В 1855 г. уехал в Одессу, где преподавал в гимназии при Ришельевском лицее. Благодатный южный климат позволил Менделееву уже в следующем году вернуться в Петербург. Он защитил магистерскую диссертацию и приступил к чтению лекций по органической химии в Петербургском университете.
В 1859—1861 гг. посетил Германию «для усовершенствования в науках», а по возвращении на родину издал первый в России учебник по органической химии, который был удостоен Демидовской премии.
В 1865 г. Менделеев защитил докторскую диссертацию, заложившую основы учения о растворах.
В 1869 г. учёный совершил одно из величайших открытий в истории химии — вывел периодический закон химических элементов. В 1871 г. вышел его классический труд «Основы химии», где обобщались представления о любимой науке.
Дмитрий Иванович отдавал много сил преподавательской деятельности — был профессором Петербургского университета, вёл курсы в других учебных заведениях. На склоне лет он отмечал: «Из тысяч моих учеников много теперь повсюду видных деятелей, профессоров, администраторов, и, встречая их, всегда слышал, что доброе в них семя полагал, а не простую отбывал повинность».
В 1890 г. Менделеев покинул университет в знак протеста против притеснения студенчества. Несколько лет учёный был консультантом научно-технической лаборатории Морского министерства; в 1892 г. он организовал производство изобретённого им бездымного пороха.
С 1892 г. и до конца своей жизни Дмитрий Иванович возглавлял Главную палату мер и весов.
Скончался 2 февраля 1907 г. в Петербурге.