Ключевые слова: Свободно-радикальное окисление, сахарный диабет 2 типа, супероксиддисмутаза, каталаза.
Сахарным диабетом 2 типа (СД 2), согласно данным Международной диабетической федерации в мире страдает свыше 170 млн. человек. Окислительный стресс, возникающий в результате дисбаланса между чрезмерным усилением свободно-радикальных процессов и недостаточной функциональной активностью антиоксидантной системы организма, выступает в качестве универсального патогенетического механизма повреждения биомолекул, клеток и их структурных компонентов при СД 2. Нарушения метаболизма при СД 2 взаимосвязаны с пониженной секрецией инсулина и инсулинорезистентностью.
Постоянный уровень свободно-радикального окисления (СО) поддерживается за счет согласованной системы антиоксидантной защиты, включающей ферментативное и неферментативное звенья и осуществляющей контроль за содержанием активных форм кислорода (АФК).
Важными компонентами анитоксидантной системы являются супероксиддисмутаза и каталаза, обеспечивающие элиминацию суперокисиданионрадикала и пероксида водорода соответственно.
Цель данной работы – исследование активности СОД и каталазы в сыворотке крови пациентов с СД 2, а также оценка активности и уровня транскриптов генов данных ферментов в эксперименте на животных при индуцировании данной патологии у крыс.
В ходе клинического исследования использовали сыворотку крови 98 человек, среди которых 65 практически здоровых лиц с нормальными показателями общего и биохимического анализов крови – 1 группа (контрольная), 2 группа – 33 пациента с СД 2, осложненным неалкогольным стеатогепатитом, находящихся на лечении в стационаре. Кровь для исследования забиралась в пробирки типа «вакутейнер» в утреннее время, натощак, из локтевой вены. Исследования проводились в соответствии с требованиями биомедицинской этики согласно Женевской конвенции о правах человека (1997 г.) и Хельсинской декларации Всемирной медицинской ассоциации (2000 г.) на основании разрешения локального этического комитета, в связи с чем, у всех пациентов было получено письменное добровольное информированное согласие на участие в клиническом исследовании.
В экспериментальном исследовании использовались белые лабораторные крысы- самцы массой 150-200 г. Животные содержались на стандартном режиме вивария. Все манипуляции, проводимые во время эксперимента, соответствовали требованиям международных правил гуманного отношения к животным, отраженных в санитарных правилах по отбору и содержанию экспериментально-биологических клиник (вивариев) (УК РФ ст. 245).
Развитие экспериментального СД 2 было индуцировано внутримышечными инъекциями протамин-сульфата (Sigma-Aldrich Co., США) на протяжении трех недель в дозе 10 мг/кг массы тела животного в объеме 0,5 мл физиологического раствора, 3 раза в сутки.
В ходе исследования животные были разделены на экспериментальные группы:
- 1 группа (n = 16) – контрольные животные;
- 2 группу (n = 16) — составляли животные с СД 2;
- Активность СОД определяли на спектрофотометре при λ=540 нм.
Определение активности проводили по ингибированию скорости восстановления нитросинего тетразолия в неэнзимотической системе феназинметасульфата и НАДН.
Активность каталазы определяли спектрофотометрически при длине волны λ=410 нм. В основе метода лежит способность Н2О2 образовывать с молибдатом аммония стой- кий окрашенный комплекс.
Для определения уровня транскриптов генов СОД (Sod1) и каталазы (Cat) проводили выделение суммарной клеточной РНК с использованием набора «РНК-Экстран» (Синтол, Россия) согласно рекомендациям фирмы-производителя. Для проведения ПЦР- РВ в присутствии интеркалирующего красителя SYBR Green I использовали набор реак- тивов фирмы «Синтол» (Россия). В качестве матрицы использовали кДНК, полученную на предыдущем этапе.
Данные обрабатывали с использованием стандартных статистических методов.
Результаты клинических исследований показали, что при СД 2, осложненном неалкогольным стеатогепатитом, активность СОД, выраженная в Е на мл сыворотки крови, уменьшалась в среднем в 1,4 (p<0,05) раза по сравнению с нормой. При этом удельная активность фермента снижалась на 30,6 % (p<0,05). Выявленные изменения могут быть связаны как с истощением активности данного компонента АОС, так и с повышением уровня антител к СОД в условиях патологии, что может приводить к угнетению функционирования фермента.
У пациентов с данной патологией, активность каталазы, выраженная в Е на мл сыворотки крови, возрастала в среднем в 2,2 (p<0,05) раза по сравнению с нормой. При этом удельная активность фермента повышалась в 1,4 (p<0,05) раза. Полученные данные отражают мобилизацию данного звена АОС в ответ на развитие оксидативного стресса в организме пациентов. Таким образом, выявлен дисбаланс в работе данной ферментативной антиоксидантной системы, что, по-видимому, сопряжено с длительным течением заболевания и нарушениями свободнорадикального гомеостаза и ряда обменных процессов в организме в стадии декомпенсации.
В ходе исследований в эксперименте на животных с экспериментальным СД2 обнаружено увеличение удельной активности СОД в сыворотке крови – в 1,9 раза по сравнению с контрольными животными. Кроме того, выявлено возрастание удельной активности каталазы в сыворотке крови – в 2,7 раза. Вероятно, рост активности исследуемых ферментов носит адаптивно-компенсатоный характер в ответ на чрезмерное образование АФК. Известно, что при диабете наблюдается интенсификация генерации O2 — митохондриями, ксантиноксидазой, цитохромом Р-450, а также НАДН/НАДФН-оксидазой, что может явиться причиной повышения активности СОД и, как следствие, каталазы.
Нужна помощь в написании статьи?
Мы - биржа профессиональных авторов (преподавателей и доцентов вузов). Пишем статьи РИНЦ, ВАК, Scopus. Помогаем в публикации. Правки вносим бесплатно.
Очевидно, что на исследуемом этапе экспериментального СД 2 имела место стадия компенсации.
Для определения уровня экспрессии генов антиоксидантных ферментов было проведено выделение тотальной РНК из образцов тканей экспериментальных животных. Качество выделенной РНК определяли путем электрофореза образцов в 1 % агарозном геле. При анализе электрофореграммы было выявлено наличие двух ярких полос, соответствующих 28S- и 18S-рибосомальной РНК, что свидетельствует об отсутствии деградации образцов в процессе выделения.
Концентрацию и чистоту полученных образцов РНК определяли спектрофотеметрически. Образец считали чистым и пригодным для дальнейших манипуляций, когда со- отношение оптических плотностей при 260 и 280 было около 2,0, а соотношение при 260 и 230 было в диапазоне 2,0-2,2. В случае получения существенно низких результатов, проводили повторное выделение РНК.
Синтез кДНК проводили с использованием oligo(dT)15 праймера и фермента M- MuLV – генетически модифицированной обратной транскриптазы вируса лейкемии мышей. В результате была получена библиотека кДНК, экспрессирующихся генов.
В ходе анализа экспрессии генов Sod1 и Cat результаты были нормированы относительно контрольного гена GAPDH.
В результате проведенных исследований было установлено, что при развитии экспериментального СД 2 уровень транскриптов СОД и каталазы возрастал в сыворотке в 1,8 раза. Обнаруженные изменения в уровне транскриптов генов антиоксиднатных ферментов, вероятно, являются адаптивной реакцией организма на увеличение генерации АФК при развитии патологии.
Таким образом, выявлены изменения активностей СОД и каталазы в крови пациентов с СД 2, а также уровня активности данных ферментов и транскриптов Sod1 и Cat в эксперименте на животных. Выявленный дисбаланс в работе данных антиоксидантных ферментов у больных с СД 2 может являться следствием декомпенсации нарушений свободнорадикального гомеостаза, сопряженных со значительными сдвигами метаболизма в ходе протекания заболевания.
Список использованных источников
1. Арутюнян A. B. Механизмы свободнорадикального окисления и его роль в ста- рении / A. B. Арутюнян, О. C. Козина // Успехи геронтологии. –2009. – № 1. – С. 104-116.
2. Дубинина Е. Е. Биологическая роль супероксидного анионрадикала и супероксиддисмутазы в тканях организма / Е. Е. Дубинина // Успехи современной биологии. – 1989. – Т. 108, № 1. – С. 3-12.
3. Ллойд Э. Справочник по прикладной статистике / Э. Ллойд, У. Ледерман // М.: Финансы и статистика, 1990. – 526 с.
4. Матюшин Б. Н. Определение супероксиддисмутазной активности в материале пункционной биопсии печени при ее хроническом поражении / Б. Н. Матюшин, А. С.Логинов, В. Д. Ткачев // Лаб. дело. – 1991. – № 7. – С. 16-19.
5. Метод определения активности каталазы / М. А. Королюк [и др.] // Лаб.дело. – 1988. – №. 1. – С. 16-19.
6. Ульянов А. М. Инсулярная система животных при хроническом дефиците гепарина / А. М. Ульянов, Ю. А. Тарасов // Вопросы медицинской химии. – Т. 46, № 2. – 2000.
– C. 149-154.