Методами молекулярного клонирования на основе вектора pET32b(+) созданы две генно-инженерные конструкции, несущие гены анальгетических полипептидов. Проведена аналитическая экспрессия гибридных белков. Показано, что полипептиды экспрессируются в растворимом виде.
ABSTRACT
To obtain new analgesic polypeptides using computer modeling methods two sequences HCGS 1.10 and 1.36 from a combinatorial library of Kunitz-type polypeptides of the sea anemone Heteractis crispa were selected. It was shown that point amino acid substitutions in the polypeptides do not prevent to the interaction with TRPV1-receptor. Using molecular cloning techniques based on vector pET32b (+) two constructs with the analgesic polypeptides genes were created. The analytical expression of the fusion proteins was performed. It was shown that the polypeptides are expressed in a soluble form.
Ключевые слова: комбинаторная библиотека; анальгетические полипептиды; компьютерное моделирование; молекулярное клонирование, экспрессия.
Keywords: combinatorial library; analgesic polypeptides; computer modeling; molecular cloning; expression.
Полипептиды Кунитц-типа широко представлены как в наземных, так и морских ядовитых организмах и являются компонентами не только ядов, но и секрета кожи. Они проявляют разнообразные виды биологической активности, действуют на различные биологические мишени (ферменты, ионные каналы и ионотропные рецепторы), могут играть важную роль в выживании животных, защите от деградации полипептидных токсинов и других белковых компонентов яда и/или в формировании синергетического эффекта действия компонентов яда. Согласно литературным данным ряд полипептидных молекул с разнообразными функциями, продуцируемых ядовитыми организмами, имеет Кунитц-фолд. Природа, вероятно, «отбирала» этот мотив как общий каркас для проявления различных видов биологической активности [10, 11, 15]. Установлено, что в ядах змей, скорпионов, пауков, конусов и актиний полипептиды Кунитц-типа продуцируются в виде многочисленных изоформ и образуют природные комбинаторные библиотеки. В настоящее время полипептиды Кунитц-типа представляют фундаментальный интерес, заключающийся в получении на их основе высокоспецифичных инструментов для исследования различных биологических мишеней и создания лекарственных препаратов нового поколения. Однако близкие значения физико-химических характеристик нативных полипептидов создают серьезную проблему при выделении данных соединений в индивидуальном состоянии. Кроме того, поиск и установление первичной структуры минорных изоформ полипептидов сложно осуществить методами белковой химии, которые требуют значительного количества исходного сырья.
В то же время анализ аминокислотных последовательностей и пространственных структур полипептидов комбинаторных библиотек с помощью методов молекулярной биологии и компьютерного моделирования позволяет быстро получить полную информацию о многообразии существующих изоформ и специфичности действия на биологические мишени. Эти современные методологические подходы дают возможность получения отдельных полипептидов, потенциальных кандидатов для создания фармакологических препаратов с заданными свойствами в рекомбинантной форме, что способствует сохранению численности популяций морских гидробионтов.
Ранее установлено, что 33 представителя HCGS-полипептидов образуют комбинаторную библиотеку полипептидов Кунитц-типа актинии Heteractis crispa [12]. С целью структурно-функционального анализа полученных структур для каждого GS-полипептида комбинаторной библиотеки с помощью программы SPDBV [16] был рассчитан молекулярный электростатический потенциал (МЭП) и построены эквипотенциальные поверхности, представляющие собой трехмерную визуализацию МЭП (рис. 1). МЭП является важной характеристикой белковой молекулы и определяет ее специфичность и кинетику молекулярного связывания [17].
Рисунок 1. Дендрограмма полипептидов Кунитц-типа актинии H. crispa, SHPI-1 актинии Stichodactyla helianthus [7] и BPTI — полученная с применением программы PIPSA и сервера webPIPSA [17, 9]. Структуры макромолекул полипептидов представлены в виде ленточной диаграммы (обозначены черным цветом). Справа от дендрограммы представлены эквипотенциальные поверхности, характерные для данной группы полипептидов в кластерах А — Г. Расчеты МЭП выполнены в программе SPDBV (цветовое обозначение: темно-серый — отрицательный потенциал, светло-серый — положительный потенциал).
Как правило, полипептиды с близкими электростатическими свойствами имеют сходный механизм связывания с мишенями и, возможно, одинаковую биологическую активность. Было отмечено, что для HCGS-полипептидов характерно несколько типов МЭП. В результате проведенного анализа подобия МЭП представителей комбинаторной библиотеки, ингибитора протеиназ SHPI-1 из актинии Stichodactyla helianthus и BPTI — как наиболее изученного представителя структурного семейства Кунитца, полипептиды были разделены на четыре кластера (рис. 1).
Особый интерес представляют представители комбинаторной библиотеки, которые характеризуются точечным распределением МЭП и формируют кластер А. Идентичность последовательностей внутри данной группы составляет 84—98 %. В отличие от других представителей комбинаторной библиотеки HCGS, эти полипептиды имеют остатки Thr (положение 14) в центре реактивного сайта и Glu (положение 38) в сайте слабых взаимодействий с сериновыми протеиназами. В этом кластере можно выделить две подгруппы соединений: одна из них образована полипептидами, гомологичными ингибитору трипсина Jn-IV [3] со степенью идентичности аминокислотной последовательности внутри подгруппы 88—98 %, и другая — гомологичными анальгетическим полипептидам APHC1-APHC3 [5, 4] со степенью идентичности 91—98 %.
Принимая во внимание столь высокую степень идентичности аминокислотных последовательностей и общий характер распределения МЭП, мы можем предположить, что новые HCGS-полипептиды (1.10, 1.26, и 1.36), которые группируются с APHC1-APHC3 (рис. 1), должны, помимо трипсинингибирующей активности (Ki ~ 10-6—10-7 М), обладать способностью модулировать in vitro болевой ваниллоидный рецептор TRPV1 и оказывать анальгетическое действие in vivo. Поэтому для создания генно-инженерных конструкций были выбраны две последовательности GS-полипептидов, а именно HCGS 1.10 и HCGS 1.36, которые содержат положительно заряженные остатки Arg18 и Arg48 (рис. 2), вносящие, согласно литературным данным [5], существенный вклад в модулирование функциональной активности TRPV1-рецептора.
Jn-IV —-GSICLEPKVVGPCTAYFPRFYFDSETGKCTPFIYGGCEGNSYVDEKLHACRAICRA——
HCGS 2.3 —-GSICLEPKVVGPCTAYFPGFYFDSETGKCTPFIYGRCEGNGNNFETLHACRAICRA——
HCGS 1.27 ——GSICLEPKVVGPCTAYFPRFYFDSETGKCTPFIYGGCEGNGNNFETLHACRAICRA——
HCPG 1.34 —-GSICLEPKVVGPCTAYFPRFYFDSETGKCTPFIYGGCEGSGNNFETLHACRAICRA——
HCGS 1.10 —-GSICLEPKVVGPCTAYLRRFYFDSETGKCTPFIYGGCEGNGNNFETLRACRAICRA——
APHC1 —-GSICLEPKVVGPCTAYFRRFYFDSETGKCTVFIYGGCEGNGNNFETLRACRAICRA——
Нужна помощь в написании статьи?
Мы - биржа профессиональных авторов (преподавателей и доцентов вузов). Пишем статьи РИНЦ, ВАК, Scopus. Помогаем в публикации. Правки вносим бесплатно.
HCGS 1.36 —-GSICLEPKVVGPCTAYFRRFYYDSETGKCTPFIHGGCEGNGNNFETLRACRAICRA——
APHC2 —-GSICLEPKVVGPCTAYFRRFYFDSETGKCTPFIYGGCEGNGNNFETLRACRAICRA——
APHC3 —-GSICLEPKVVGPCTAYFPRFYFNSETGKCTPFIYGGCEGNGNNFETLRACRGICRA——
HCGS 1.26 —-GSICLEPKVVGPCTAYFRRFYFDSETGKCTPFIYGGCEGNGNNFETLHACRAICRA——
HCGS 2.5 —-GSICLEPKVVGPCTAYFRRFYFDSETGKCTPFIYGGCEGNGNNFETLRACRAICRA——
Рисунок 2. Множественное выравнивание аминокислотных последовательностей GS-полипептидов кластера А. Подчеркнуты полипептиды, входящие с нативными анальгетиками APHC1 и APHC2 [5, 4] в состав двух «анальгетических» подгрупп.
Механизм взаимодействия полипептидов HCGS 1.10 и HCGS 1.36 с TRPV1 рецептором был установлен на основании построенной ранее c помощью метода молекулярного докинга структурной модели комплекса APHC1-TRPV1 [1], а также проведенного in silico-мутагенеза APHC1 в комплексе с болевым рецептором. Согласно результатам молекулярного моделирования и молекулярной динамики, проведенным с использованием программы МОЕ, единичные негомологичные аминокислотные замены не должны оказывать существенного влияния на прочность связывания полипептидов данной группы с болевым рецептором.
Так полипептид HCGS 1.10 отличается от APHC1 несколькими заменами. Замена Phe17 на Leu локализована в участке ароматического кластера, который отличает группу полипептидов, обладающих анальгетической активностью, от других представителей комбинаторной библиотеки H. crispa полипептидов Кунитц-типа. В то время как замена Val31 на Pro также присутствует в полипептиде APHC3 и не приводит к утрате анальгетического действия полипептида. Молекулярно-динамические расчеты комплекса HCGS 1.10-TRPV1 в водном окружении при рН 6,0 показали, что замена Phe17Leu не привела к заметному изменению количественных характеристик взаимодействия с рецептором по сравнению с комплексом APHC1-TRPV1. При этом замена ароматического аминокислотного остатка Phe на алифатический Leu не препятствовала образованию кластера π- катионных взаимодействий между полипептидом и рецептором: Arg18-B:Phe721-B:Met717 и Ile 33-Tyr16-B:Arg718 (рис. 3).
Рисунок 3. Межмолекулярные взаимодействия полипептида HCGS 1.10 с TRPV1. Аминокислотные остатки в комплексе представлены в виде стержневой диаграммы. Водородные связи и π-катионные взаимодействия показаны пунктирными линиями.
Ранее нами было показано, что Val31 анальгетического полипептида APHC1 образует водородную связь с Lys719 субъединицы D рецептора TRPV1 [1]. Однако присутствие остатка Pro в этом положении у всех полипептидов «анальгетической группы», за исключением APHC1, не создает пространственных или иных препятствий для взаимодействия с болевым рецептором. Это хорошо согласуется с экспериментальными данными об анальгетическом действии APHC3 [4].
Полипептид HCGS 1.36, помимо выше упомянутой замены в положении 31, содержит еще две замены: Phe22Tyr и Tyr34His. Несмотря на то, что эти замены отличают данный полипептид от всех остальных представителей группы, нами не выявлено сколь-нибудь важных изменений во взаимодействиях TRPV1 рецептора с полипептидом по сравнению с другими представителями группы. Phe22 полипептида HCGS 1.36 в составе комплекса с TRPV1 локализован на периферийной части области контактов, и его боковая часть не экспонирована в интерфейс межмолекулярных взаимодействий. По-видимому, влияние этого остатка может быть существенным лишь с точки зрения стабильности самого полипептида, но не его комплекса с TRPV1 рецептором. His34, так же как и Tyr34 в комплексе APHC1-TRPV1, не вовлечен во взаимодействие с рецептором, хотя его боковая цепь экспонирована в интерфейс в области Lys719 и Ala720 субъединицы B рецептора.
Таким образом, показано, что единичные аминокислотные замены в полипептидах HCGS 1.36 и HCGS 1.10 не представляют стерических или электростатических препятствий для взаимодействия с болевым рецептором TRPV1 и, следовательно, для проявления ими анальгетического действия in vivo. Поэтому данные полипептиды были отобраны для дальнейшего молекулярного клонирования с целью получения рекомбинантных форм и дальнейших исследований.
Широко распространенным способом получения белковых молекул является их функциональная экспрессия в клетках прокариот, например в Escherichia coli [18]. В условиях бактериальной системы высокий уровень продукции рекомбинантных полипептидов может достигаться за счет правильного выбора экспрессионной системы, оптимизации условий биосинтеза и очистки целевого белка. Наличие в рекомбинантных белках дисульфидных связей значительно осложняет продукцию функционально-активных белков, т.к. у E. coli отсутствуют ферментативные системы, отвечающие за образование дисульфидных связей и поэтому молекула такого полипептида, синтезированного в бактериальной клетке, не стабилизированная дисульфидными связями, становится очень чувствительной к протеолитической деградации [8]. Поэтому функциональную экспрессию дисульфид-содержащих белков, как правило, проводят в составе слитных конструкций в паре с геном белка-носителя тиоредоксина (Trx), который способен не только катализировать замыкание дисульфидных связей в целевом белке, но и удерживать его в растворимом состоянии, так как Trx накапливается в цитоплазме E. coli (до 40 % от общей массы клеточных белков), оставаясь при этом в растворимой форме. Кроме того, благодаря своим небольшим размерам (11675 Да) Trx, включенный в гибридный белок, не увеличивает чрезмерно его массу. Расположение на поверхности белковой молекулы Trx N- и C-концов удобно для присоединения к нему других белков [19, 13].
В линкере, соединяющем последовательности белка-носителя и целевого белка, как правило, предусмотрен сайт для последующего химического или ферментативного гидролиза гибридного белка. Гидролиз с помощью химического расщепления гибридного белка бромцианом (BrCN) позволяет получить целевой продукт с N-концевой последовательностью нативного полипептида [6]. Однако использование BrCN подходит только для белков, не содержащих собственных остатков метионина.
При выборе системы экспрессии было отдано предпочтение вектору pET32b(+), который используется для экспрессии в E. coli гибридных белков с Trx. Преимущество данной экспрессионной конструкции заключается в том, что вектор обеспечивает высокий выход целевого белка, а Trx — правильность замыкания дисульфидных связей, необходимых для формирования биологически активной структуры дисульфид-содержащих белков, к которым относятся полипептиды Кунитц-типа.
Нуклеотидные последовательности, кодирующие HCGS 1.10 и HCGS 1.36 были проверены на присутствие редких кодонов в клетке хозяина E. coli. Выбранные последовательности HCGS-полипептидов, уже содержащие на 5`-конце сайт для EcoRI рестриктазы, кодон метионина (Met), а на 3`-конце — стоп кодон (TAA) и сайт для XhoI рестриктазы, были субклонированы из вектора pTZ57R/T по сайтам рестрикции EcoRI и XhoI в вектор pET32b(+) в составе T7-контролируемого оперона (рис. 4).
Риcунок 4. Физическая карта плазмиды pET-32b-HCGS полипептид.
Остаток Met был введен перед последовательностью целевого продукта, чтобы в дальнейшем эффективно провести гидролиз BrCN гибридного белка и отщепить зрелый полипептид с нативной N-концевой последовательностью от конечного слитного белка-носителя. Собственного остатка метионина аминокислотные последовательности HCGS-полипептидов не имеют, поэтому выбранный метод химического расщепления пептидной связи можно использовать без каких-либо ограничения. Фрагменты HCGS-полипептидов встраивали после фрагмента Trx и His6-Tag, аффинно-хелатирующего Ni2+-содержащую смолу, что позволяет на стадии металлоаффиной хроматографии избавиться от большинства балластных белковых компонентов клеточного лизата [3].
Далее полученными конструкциями, обозначенными как pET32-HCGS 1.10 и pET32-HCGS 1.36, трансформировали штамм E. coli Top 10 с помощью метода электропорации, который затем высевали на чашки c твердой питательной средой, содержащей селективный антибиотик ампициллин (100 мкг/мл). Положительные клоны, содержащие рекомбинантные плазмиды, были отобраны с помощью метода ПЦР «на колониях» и проверены на отсутствие мутаций прямым секвенированием с использованием стандартных праймеров. Затем результирующими генетическими конструкциями трансформировали штамм E. coli BL21(DE3) методом электропорации для проведения аналитической экспрессии. Аналитическую экспрессию рекомбинантных полипептидов проводили в 25 мл питательной культуры при интенсивной аэрации (180 об/мин) и температуре 37°С. Наработку целевого слитного белка индуцировали добавлением 1 мМ ИПТГ. Электрофоретическое разделение компонентов клеточных лизатов в ДСН-ПААГ показало, что молекулярные массы рекомбинантных гибридных полипептидов соответствовали расчетным данным (больше 26 кДа, рис. 5). Анализ растворимых и нерастворимых фракций бактериальных лизатов показал, что рекомбинантные гибридные HCGS-полипептиды содержатся только в растворимых фракциях.
Рисунок 5. Электрофореграмма гибридных белков. Клеточные лизаты BL21(DE3) штаммов-продуцентов E. coli: 1 — pET32b- rHCGS1.10; 2 — pET32b-rHCGS1.36; 3 — контроль (pET32b-Trx без добавления ИПТГ); 4 — белки-стандарты молекулярной массы; 5 — контроль pET32b-Trx.
Таким образом, в результате проделанной работы созданы две генно-инженерные конструкции, несущие гены анальгетических HCGS-полипептидов, на основе вектора pET32b(+) и проведена аналитическая экспрессия гибридных рекомбинантных белков Кунитц-типа актинии H. crispa. Показано, что два гибридных рекомбинантных HCGS-полипептида экспрессируются в растворимом виде.
Список литературы:
1.Зелепуга Е.А., Табакмахер В.М., Чаусова В.Е., Монастырная М.М., Исаева М.П., Козловская Э.П. Взаимодействие полипептидов кунитц-типа актинии Heteractis crispa с болевым ваниллоидным рецептором ТRPV1: in silico исследование // Биоорг. химия. — 2012. — Т. 38, C. 185—198.
2.Зыкова T.A., Винокуров Л.M., Mаркова Л.Ф., Koзловская Э.П., Еляков Г.Б. Аминокислотная последовательность ингибитора трипсина IV из Radianthus macrodactylus // Биоорг. xимия. — 1985. — Т. 11, С. 293—301.
3.Иванов А.С., Згода А.И., Арчаков В.Г. Технологии белковой интерактомики // Биоорг. химия. — 2011. — Т. 37, № 1. С. 8—21.
Нужна помощь в написании статьи?
Мы - биржа профессиональных авторов (преподавателей и доцентов вузов). Пишем статьи РИНЦ, ВАК, Scopus. Помогаем в публикации. Правки вносим бесплатно.
4.Козлов С.А., Андреев Я.А., Мурашев А.Н., Скобцов Д.И., Дьяченко И.А., Гришин Е.В. Новые полипептидные компоненты с анальгетической активностью из морской анемоны Heteractis crispa // Биоорг. химия. — 2009. — Т. 35. С. 789—798.
5.Andreev Y.A., Kozlov S.A., Koshelev S.G., Ivanova E.A., Monastyrnaya M.M., Kozlovskaya E.P., Grishin E.V. Analgesic compound from sea anemone Heteractis crispa is the first polypeptide inhibitor of vanilloid receptor 1 (TRPV1) // J. Biol. Chem.— 2008. — V. 283. P. 23914—23921.
6.Andreev Y.A., Kozlov S.A., Vassilevski A.A., Grishin E.V. Cyanogen bromide cleavage of proteins in salt and buffer solutions // Anal Biochem. — 2010. — V. 407, N 1. P. 144—146.
7.Antuch W., Berndt K.D., Chavez M.A., Delfín J., Wüthrich K. The NMR solution structure of a Kunitz-type proteinase inhibitor from the sea anemone Stichodactyla helianthus // Eur. J. Biochem. — 1993. — V. 212, P. 675—684.
8.Berndt C., Lillig C.H., Holmgren A. Thioredoxins and glutaredoxins as facilitators of protein folding // Biochim. Biophys. Acta. — 2008. — V. 1783, N 4. P. 641—650.
9.De Rienzo F., Gabdoulline R.R., Menziani M.C., De Benedetti P.G., Wade R.C. Electrostatic Analysis and Brownian Dynamics Simulation of the Association of Plastocyanin and Cytochrome F // Biophys. J. — 2001. — V. 81, P. 3090—3104.
10.Escoubas P. Molecular diversification in spider venoms: a web of combinatorial peptide libraries // Mol. Divers. — 2006. — V. 10. P. 545—554.
11.Fry B.G. From genome to «venom»: molecular origin and evolution of the snake venom proteome inferred from phylogenetic analysis of toxin sequences and related body proteins // Genome Res. — 2005. — V. 15, N 3. P. 403—420.
12.Isaeva M.P., Chausova V.E., Zelepuga E.A., Guzev K.V., Tabakmakher V.M., Monastyrnaya M.M., Kozlovskaya E.P. A new multigene superfamily of Kunitz-type protease inhibitors from sea anemone Heteractis crispa // Peptides. — 2012. — V. 34. P. 88 — 97.
13.McCoy J., Lavallie E. Expression and purification of thioredoxin fusion proteins // Curr. Protoc. Mol. Biol. — 2001. — Chapter 16:Unit16.8.
14.Novagen. pET System Manual. 2008. 11th edition.
15.Olivera B.M., Hillyard D.R., Marsh M., Yoshikami D. Combinatorial peptide libraries in drug design: lessons from venomous cone snails // Trends Biotechnol. — 1995. — V. 13, N 10. P. 422—426.
16.Peitsch M.C. Protein modeling by E-mail // Nat. Biotechnol. 1995. V. 13. P. 658—660.
17.Richter S., Wenzel A., Stein M., Gabdoulline R.R., Wade R.C. webPIPSA: a web server for the comparison of protein interaction properties // Nucleic Acid Res. — 2008. — V. 36, P. 276—280.
18.Rudolph R. Successful protein folding on an industrial scale // Protein engineering: principles and practice. New York: Wiley-Liss. — 1996. P. 283—298.
19.Yasukawa T., Kanei-Ishii C., Maekawa T., Fujimoto J., Yamamoto T., Ishii S. Increase of solubility of foreign proteins in Escherichia coli by coproduction of the bacterial thioredoxin // J. Biol. Chem. — 1995. — V. 270, N 43. P. 25328—25331.