В настоящее время исследованиям микробной экологии растущих животных посвящено уже значительное количество работ [3], однако в абсолютном большинстве они касаются рассмотрения бактериальной составляющей, в то время как рассмотрение бактериофагов, составляющих единую микроэкологическую систему с изучаемыми бактериями-хозяевами, остаётся практически без внимания исследователей.
В то же время известно, что не только умеренные, но и вирулентные бактериофаги фаги могут играть существенную роль в развитии патогенности, осуществляя трансдукцию генов факторов патогенности и генов антибиотикорезистентности [5]. Тем более такая ситуация парадоксальна в отношении фагов E.coli, которых можно назвать самыми изученными (в т. ч. — и по причине их применения в качестве основы профилактических и терапевтических антибактериальных препаратов [10], рассматриваемых в настоящее время как реальная альтернатива антибиотикам). При таком подходе в поле зрения исследователей циркуляции генов патогенности в бактериальных популяциях остаётся преимущественно один механизм горизонтального переноса — конъюгация [2], тогда как механизму трансдукции in vivo уделяется значительно меньшее внимание.
Так, комплексное изучение спектра популяций энтеробактерий клинически здоровых свиней синхронно с описанием профиля генов факторов патогенности, циркулирующих в данной популяции [7, 8] стало совершенно недавним подходом. Однако и в данных работах отсутствует описание фаговых популяций бактерий (в т. ч. — и E.coli). Крайне немногочисленные работы, посвящённые описанию фаговых профилей микробиоценозов животных [1], пока ещё не дают возможность составить полноценную картину систем «бактерия-фаг-плазмида» в отношении значимых бактериальных популяций.
Целью нашего исследования был детальный комплексныйанализ возрастных количественных и качественных изменений в популяционном составе кишечной палочки, входящей в состав нормофлоры пищеварительного тракта свиней параллельно с исследованием динамики изменений в популяционном составе бактериофаговE. coli (коли-фагов).
У трёх животных (поросята породы СМ-1), содержащихся в одном гнезде, отбирались образцы содержимого толстой кишки в динамике (с интервалом 3—7 дней): в возрасте 17, 21, 24, 27, 31, 35, 39, 42, 46, 53, 59, и 66 дней. Отъём от свиноматки осуществлялся на 35 день жизни. Условия содержания и кормления обоих животных были одинаковы на протяжении всего периода наблюдения.
После отбора фекалий животных каждый из образцов делился на две части, одна из которых в дальнейшем использовалась как объект для анализа содержания в нём кишечной палочки, а другая — как объект для анализа содержания коли-фагов и их выделения.
Количество E.coliопределяли посевами на среду Эндо и измеряли в lg КОЕ/г. В отношении каждого изолята, подозрительного на E.coli, осуществляли идентификацию, оценивая их метаболическую активность и профиль метиловых эфиров жирных кислот структурных липидов (fattyacidmethylethers — FAME-profile), определяемого хроматографически. У всех выделенных изолятов E.coli определяли спектр антибиотикорезистентности к набору из 24 антибиотиков, а также исследовали плазмидный профиль, используя щелочной метод выделения плазмидной ДНК.
Количественная оценка (титр) содержания бактериофагов E.coli (коли-фагов) в исследуемом биоматериале осуществлялась путём подсчёта бляшек после первичного посева (выполненного методом агаровых слоёв) на лабораторный штамм E.coli B, выражая её в lg БОЕ/г.
По результатам исследования было установлено, что титр E.coli колебался в границах от 1,44 до 5,75 lg КОЕ/г. При этом коли-титр имел своеобразную динамику: нарастая с 3,23 (17 день) до 4,32 lg КОЕ/г (27 день), он снижался к 31 дню до 3,20 lg КОЕ/г, после чего значительно вырастал до 5,75 lg КОЕ/г (46 день) и критическипадал до 1,44 lg КОЕ/г (53 день); к 59—66 дню наблюдался подъём до значений 4,18—3,04 lg КОЕ/г. При этом интересно отметить, что в большинстве случаев в каждой пробе определялся один штамм E.coli; лишь в 42 дня и в 66 дней определялось два разных штамма E.coli одновременно у двух поросят. При этом, даже если в пробе обнаруживалось два штамма E.coli, один из них выделялся в титре, на 0,5—3,3 lg КОЕ/г превосходящем титр другого штамма. Также интересно отметить, что в возрасте 21 день у всех животных не выделялись E.coli, в то время, как на среде Эндо выделялсь бактерии родов Serratia и Proteus.
Ососбого внимания заслуживает тот факт, установленный сравнительной оценкой плазмидного профиля изолятов, что ни у одного животного не удалось проследить сохранение персистенции в пищеварительном тракте хотя бы одного штамма E.coli на протяжении хотя бы одного периода между отборами проб. Тем более, ни один из выделенных штаммов не обнаруживался в дальнейшие периоды. Данные различий плазмидного профиля подтверждались различиями в спектре антибиотикорезистентности.
Исследование динамики коли-фагов показало практически линейное снижение титра коли-фагов в течение всего периода наблюдения: с 17 по 66 день титр коли фагов падал с 5,11 lg БОЕ/г до неопределяемых значений (менее 0,33 lg БОЕ/г); исключением стали локальные подъёмы титра коли-фагов с 3,53 lg БОЕ/г (24 день) до 4,53 — 4,78 lg БОЕ/г (27 — 31 дни) и с 1,47 lg БОЕ/г (42 день) до 2,22 lg БОЕ/г (46 день).
При этом разнообразие определяемых в пробах коли-фагов практически коррелировало с их количеством: в возрасте от 17 до 39 дней в пробах определялось минимум 2 типа коли-фагов (в 17, 21 и 27 дней у некоторых поросят определялись по 3 коли-фага в пробе), тогда как в 42 дня и позднее количество типов коли-фагов составляло от 0 до 2.
Таким образом, установлено, что коли-титр и титра коли-фагов у поросят первых двух месяцев жизни обладает характерной динамикой, особенно характерной для титра коли-фагов (выраженная тенденция к снижению). Также установлена чрезвычайная пластичность популяционного состава бактерий E.coli нормофлоры пищеварительного тракта свиней, характеризующаяся короткой (не более 3—4 дней в возрасте 17—46 дней и не более 6—7 дней в возрасте 46—66 дней) персистенцией каждого определяемого штамма.
Список литературы:
Callaway, T., Edrington, T., Varey, P., Raya, R., Brabban, A., Kutter, E., Jung, Y., Genovese,K., Elder, R., Nisbet, D.J. (2003). Isolation of naturally occurring bacteriophage from sheep that reduce populations of Escherichia coli O157:H7 In Vitro And In Vivo. 5th International Symposium on ‘Shiga Toxin(Verocytotoxin) — Producing Escherichia coli Infections’, O-16.
Cernat R, Lazăr V, Balotescu C, Cotar A, Coipan E, Cojocaru C. Distribution and diversity of conjugative plasmids among some multiple antibiotic resistant E.coli strains isolated from river waters Bacteriol Virusol Parazitol Epidemiol. 2002 Jul-Dec;47(3—4):147—53.
Holzapfel W.H., Naughton P. J. Microbial ecology in growing animals, 2005 Elsevier: 522 p.
Katouli, M., Lund, A., Wallgren, P., Kuhn, I., Soderlind, O. & Mollby, R. (1995). Phenotypic characterization of intestinal Escherichia coli of pigs during suckling, postweaning, and fattening periods. Appl Environ Microbiol 61, 778—783.
Kenzaka T, Tani K, Sakotani A, Yamaguchi N, and Nasu M. High-Frequency Phage-Mediated Gene Transfer among Escherichia coli Cells, Determined at the Single-Cell Level. Appl Environ Microbiol. 2007 May; 73(10): 3291—3299.
Nagy, B., Fekete, P.Z. (2005). Enterotoxigenic Escherichia coli in veterinary medicine. Int J Med Microbiol 295, P. 443—454.
Schierack P, Römer A, Jores J, Kaspar H, Guenther S, Filter M, Eichberg J, Wieler LH. Isolation and characterization of intestinal Escherichia coli clones from wild boars in Germany. Appl Environ Microbiol. 2009 Feb;75(3):695—702.
Schierack P, Steinru¨ck H, Kleta S,Vahjen W (2006) Virulence Factor Gene Profiles of Escherichia coli Isolates from Clinically Healthy Pigs. Appl. and Env. Microbiol. Vol. 72, № 10: 6680—6686
Schierack P., Walk N., Reiter K., Weyrauch K.D. and Wieler L.H. Composition of intestinal Enterobacteriaceae populations of healthy domestic pigs. Microbiology 153 (2007), 3830—3837.
Smith HW, Huggins MB (1983) Effectiveness of phage treatment in experimental Escherichia coli diarrhoea in calves, piglets and lambs. J Gen Microbiol 129: 2659—2675.