История открытия аскорбиновой кислоты уходит далеко в прошлое, но даже сегодня не прекращается полемика о значении витамина С для здоровья человека, об оптимальных дозах витамина, которые следует принимать, поскольку в процессе эволюции человек утратил способность синтезировать аскорбиновую кислоту в организме. Его роль в лечении простудных заболеваний, в улучшении состояния раковых больных и другие медицинские аспекты являются темами оживленных дискуссий [3].
L-Аскорбиновая кислота обнаружена в организмах многих животных и у всех представителей растительного мира, во всех частях растений, и часто в больших количествах. Рассматривая любой растительный продукт, человек оценивает его компонентный состав с точки зрения полезного действия на физиологическое состояние своего организма. Несмотря на это, любое растение синтезирует вещества, прежде всего, в своих целях. Так, аскорбиновая кислота, обладая способностью обратимо окисляться и восстанавливаться, принимает участие в важнейших энергетических процессах растительной клетке – фотосинтезе и дыхании; является признанным антиоксидантом. Несомненно, её участие в процессах роста, цветения, вегетативной и репродуктивной дифференциации, в водном обмене, регуляции ферментативной активности, стимуляции реакций метаболизма, связанных с обменом нуклеиновых кислот и синтезом белка, в защитных реакциях растений [3, 7].
Литературные данные об уровне накопления витамина С в ягодах клюквы болотной носят довольно противоречивый характер. По одним данным концентрация витамина С по мере созревания ягод увеличивается и достигает максимального значения в полузрелом состоянии [2, 8], по другим – наибольшая его концентрация отмечается в зеленых ягодах [4]. Количество аскорбиновой кислоты в зрелой клюкве по разным источникам варьирует в широких пределах от 10 до 80 мг/100 г сырого веса ягод [1, 2, 4, 5, 8].
Широкий диапазон колебания концентрации аскорбиновой кислоты в ягодах вероятно связан не только с экологическими условиями их произрастания, но и в большей степени обусловлено тем многообразием методических приемов, которые используются разными исследователя при определении витамина С в биообъектах.
Цель наших исследований включала изучение накопления аскорбиновой кислоты в плодах дикорастущей клюквы болотной, произрастающей на одной территории с помощью метода высокоэффективной жидкостной хроматографии.
Объектом исследования послужили ягоды дикорастущей клюквы собранной в Сургутском районе (окрестности г. Когалым), который расположен на территории Ханты-Мансийского автономного округа. Сбор ягод производился в нескольких степенях зрелости: незрелая – конец июля (зеленая окраска), полузрелая – начало сентября (розовая окраска), зрелая – начало октября (темно-красная окраска), перезрелая – конец октября (бордовая окраска).
Таблица 1. Информация о времени сбора и степени зрелости Oxycoccus palustris
Хроматографическое измерение концентрации аскорбиновой кислоты проводили на жидкостном хроматографе «Милихром А-02» с многоволновым УФ-детектором на колонке с обращенной фазой ProntoSIL-120-5-C18 AQ DB-2003 (диаметр колонки 2 мм, длина 75 мм, размер частиц 5 мкм). Подвижная фаза: элюент А — 4M LiClO4+0.1M HClO4, элюент Б – вода; градиентный режим элюирования: 40 мин от 5 до 100 % элюента Б, 3 мин 100 % элюента Б; перед вводом пробы колонку промывают 0,8 мл подвижной фазы состава «элюент А»:»элюент Б» — 95:5 (кондиционирование колонки); скорость потока: 100 мкл/мин; детектирование: многоволновой однолучевой режим детектирования при длинах волн 210, 220, 230, 240, 250, 260, 280 и 300 нм с постоянной времени 0,18 сек; температура термостатирования колонки: (21±0,3)°С; объем вводимой пробы 5 мкл. Условия хроматографирования были подобраны экспериментально.
Концентрацию витамина С в ягодах рассчитывали по методу абсолютной градуировки. Для построения градуированной зависимости готовили серию растворов аскорбиновой кислоты в диапазоне 10—100 мг/дм3, путем разбавления нужного количества основного раствора концентрацией 300 мг/дм3. Основной раствор готовили растворением навески аскорбиновой кислоты 0,03 г в бидистиллированной воде в мерной колбе емкостью 100 см3. Градуировочные растворы 10,0; 20,0; 30,0; 50,0; 75,0; 90,0 и 100,0 мг/дм3 готовили в мерной колбе объемом 50 см3.
Анализ и подготовку проб проводили на следующий день после сбора ягод непосредственно перед измерениями. 5 г гомогенизированной смеси ягод переносили в мерную колбу и доводили бидистиллированной водой в мерной колбе на 50 см3. После этого, тщательно перемешав, отобрали 10 см3 пробы и поместили в центрифужные пробирки для отделения взвешенных частиц. Центрицугирование проводили в течение 10 мин при 7400 об/мин. Надосадочную жидкость отбирали для анализа.
Хроматографирование каждого из растворов проводили в условиях, описанных выше.
Идентификацию аскорбиновой кислоты в анализируемом образце проводили по времени удерживания обнаруженной в экстракте примеси и спектральным отношениям при семи длинах волн.
На рис. 1 и 2 представлены хроматограммы стандартного раствора аскорбиновой кислоты и исследуемых образцов ягод клюквы (например: сбор 3) соответственно.
Рисунок 1. Хроматограмма стандартного раствора аскорбиновой кислоты.
Рисунок 2. Хроматограмма экстракта ягод клюквы (Сургутский район, сбор 3).
Нужна помощь в написании статьи?
Мы - биржа профессиональных авторов (преподавателей и доцентов вузов). Пишем статьи РИНЦ, ВАК, Scopus. Помогаем в публикации. Правки вносим бесплатно.
Время удерживания стандартного образца аскорбиновой кислоты совпадает с временем удерживания обнаруженных в экстрактах примесей (пик на рис. 1. и пик 1 на рис. 2.), это позволило сделать предположение, что они соответствуют аскорбиновой кислоте.
Таблица 2. Сравнение спектральных отношений стандартного раствора аскорбиновой кислоты и пика из экстракта ягод клюквы (сбор 3)
Примечание: АК – аскорбиновая кислота.
Сравнивая спектральные отношения аскорбиновой кислоты и пика примеси из анализируемого экстракта, следует отметить их полное соответствие (табл. 2.). Кроме того, полученные спектральные параметры стандартных растворов аскорбиновой кислоты совпадают с табличными данными, приведенные в БД-2003-250 [6].
Полученные хроматограммы обрабатывали с помощью программы МультиХром (обработка данных), и был построен градуировочный график. СКО при этом составило 1,3 % (рис. 3). Градуировочный коэффициент 0,02319.
Рисунок 3. Градуировочный график для определения аскорбиновой кислоты.
Проверка воспроизводимости результатов.
Для воспроизводимости результатов провели по 7 опытов с каждым из образцов.
Для ягод клюквы сбора 1—4 получили следующие результаты (Таблица 2).
Таблица 2. Математическая обработка результатов анализа
1)