На современном этапе развития практической лектинологии имеется большой экспериментальный и клинический опыт применения лектинов в медицинской практике. Лектиновые препараты применяются в диагностике и лечении различных заболеваний [1, 2, 5, 6, 7 и др.].
Лектины — это гликопротеины, то есть сложные белки, обладающие биологической активностью. Форма белков по большей части поддерживается силами Ван-дер-Ваальса, которые очень слабы и рвутся при изменениях температуры или рН среды. Если разрушается любая из связей, стабилизирующая форму лектина, он не может выполнять свою функцию. Дестабилизация лектинов — потеря лектиновой активности в РГА с эритроцитами. Сами гликопротеины при этом могут не нарушаться, меняется только конформация и деактивируется активный центр лектинов. При действии температуры и изменении кислотно-щелочного баланса среды возможна обратимость дестабилизации, при этом лектиновая активность возвращается при оптимальной температуре и рН среды. Таким образом, денатурации молекулы лектина не происходит.
Наша цель — определить диапазон температур и рН, при которых не теряется лектиновая активность, выявить оптимальную температуру и рН наибольшей активности лектинов, а также показатели необратимой денатурации.
Для изготовления лекарственных препаратов на основе лектинов, особенно тех препаратов, которые необходимо подвергать стерилизации, важно знать оптимальные физические факторы, при которых данное лекарственное вещество не потеряет своей биологической активности и фармакологической ценности. Это явилось актуальностью наших исследований.
Объектом исследованийна кафедре биохимии и биотехнологии Башкирского государственного университета было выбрано растение KalanchoeBlossfeldiana, которое имеет многовековой опыт применения в народной и нетрадиционной медицине. Раннее нами была обнаружена высокая лектиновая активность выбранного растения, которая увеличивается при действии некоторых неблагоприятных факторах внешней среды [3, 4].
Таким образом, с целью дальнейшего изучения активности лектинов KalanchoeBlossfeldiana, в перспективе создания лекарственных препаратов на их основе, мы провели исследовательские работы по изучению влияния температуры и рН среды, в зависимости от времени, на активность лектинов KalanchoeBlossfeldiana.
Материалы и методы:
Для изучения влияния температуры и рН среды на активность лектинов KalanchoeBlossfeldianaмы применили следующий метод: для выделения и очистки фитолектинов листья KolanchoeBlossfeldianaсуспензировались и заливались ацетатным буфером (рН 3,8), помещались в холод 40С на 12 часов, а затем центрифугировались при 3000 об/мин — 15 мин. Далее использовался супернатант.
Для изучения влияния температуры по 1 мл раствора лектина ставили в различные температурные условия на разное время (интервал 100С, 30—60 минут). Анализ лектиновой активности проводился по реакции гемагглютинации с эритроцитами разной групповой принадлежности крови, взятой у практически здоровых волонтеров.
Для изучения влияния рН на активность лектинов брали по 1 мл раствора лектина маркировали и добавили ацетатный буфер, дистиллированную воду, раствор натрия гидрооксида для получения различных показателей рН. Оценивали активность по РГА.
Анализ результатов:
Для интерпретации результатов работы и достоверности исследований (каждый опыт проводился с 10 волонтёрами каждой группы крови — всего участвовало 40 волонтёров), была проведена статистическая обработка данных с помощью пакета программ «StatistikaforWindows», для статистического анализа данных использовались методы, предусматривающие определение среднеарифметических параметров и ошибок по Боровику (2001). На основании полученных данных построены графики (График 1,2), сделаны выводы.
Опыты показали, что лектины KolanchoeBlossfeldianaявляются термостабильными. Диапазон температур, при которых лектиновая активность сохраняется от +50 °С до +850 °С. Данный диапазон зависит от времени температурного воздействия. Например, при замораживании более 10 минут, происходит необратимая дестабилизация молекулы лектина и он теряет свою биологическую активность. При воздействии от 800 °С до 850 °С более 10 минут происходит тоже. Оптимальная температура, при которой сохраняется максимальная активность от +50 °С до +600 °С, в диапазоне от +650 °С до +800 °С активность лектинов снижается в зависимости от времени температурного воздействия. Температура необратимой потери биологической активности лектинов KolanchoeBlossfeldiana— более 900 °С.
График 1
График 2
Лектины KolanchoeBlossfeldianaявляются кислотоустойчивыми, оптимум рН=3,5—7,0; необратимая дестабилизация при значениях рН=1-2 и более 9,5.
Список литературы:
Булгаков А. А., Родионова О. М., Петрова И. Ю., Елисейкина М. Г., Родионов А. Ю., Апанасевич В. И. Диагностическая и прогностическая информативность нового лектиноиммуноферментного метода диагностики рака шейки матки. // Тихоокеанский медицинский журнал, № 1, 2011.— С. 96—97.
Дубовская Л. В., Радюк И. А., Тимошенко А. В., Тимошенко А. П., Тимошенко П. А., Черенкевич С. Н.Лектин-реактивные иммунные комплексы в плазме крови при ЛОР-заболеваниях. // Вестник оториноларингологии, 1998. — N 3. — С. 31—33
Усачев С. А., Ямалеева А. А. Изучение гемагглютинирующей активности лектинов KalanchoeBlossfeldiana, Chelidoniummajusи перспективы их применения в медицине // Материалы международной заочной научно-практической конференции «Естественные науки: актуальные вопросы и тенденции развития», Новосибирск, 2011.
Ямалеева А. А. Лектины растений и их биологическая роль. — Уфа: Изд-во Башк. ун-та, 2001. — 204 с.
Bionski K., Schumacher U., Bukholder J. et al. Binding of recombinant mistletoe lectin (aviscumine) to resected human adenocarcinoma of the lung // Anticancer Res. — 2005. — Vol. 25. — P. 3303—3307.
Bussing A., Schietzel M. Apoptosis-inducing properties of Viscum album L. extracts from different host trees correleate with their content of toxic mistletoe lectins // Anticancer Res. — 1999. — Vol. 19. — P. 23—28.
Choi S. H., Lyn S. Y., Park W. B. Mistlectoe lectin induces apoptosis and telomerase inhibition in human A253 cancer cells through dephosphorylation of AKT // Arch.Pharm.Res. — 2004. — Vol. 27. — P. 68—76