ABSTRACT
This article describes analysis results of sample preparation conditions for determination of chloramphenicol residue in meat by LC/MS/MS method. Efficiency of extraction of chloramphenicol from meat is studied by methods of liquid and solid-phase extraction. The maximum extent of extraction is about 99,98 %. It is reached by using liquid extraction for sample preparation.
Ключевые слова: хлорамфеникол; мясо; жидкостная экстракция; твердофазная экстракция; высокоэффективная жидкостная хроматография с масс-спектрометрическим детектированием.
Keywords: cloramphenicol; meat; liquid extraction; solid-phase extraction; liquid chromatography mass spectrometry.
Одной из задач современной аналитической химии является разработка селективных и высокочувствительных методик определения контаминантов в продуктах питания с целью оценки их влияния на здоровье населения. К числу загрязнителей пищевой продукции относятся ветеринарные препараты, в частности хлорамфеникол (левомицетин), представитель группы ароматических антибиотиков, широко используемый в ветеринарной практике для борьбы с инфекционными заболеваниями. Хлорамфеникол медленно выводится из организма животных и относительно долго сохраняет активность при хранении продуктов. При употреблении продуктов с остаточным содержанием хлорамфеникола в организме человека вырабатывается резистентность к антибиотику, может развиваться дисбактериоз, аллергические реакции, снижается иммунитет. В соответствии с СанПиН 2.3.2.1078-01 «Гигиенические требования безопасности и пищевой ценности пищевых продуктов допустимый уровень остаточного содержания хлорамфеникола в продукции составляет 0,0003 мг/кг.
При разработке методики проведения анализа контаминантов в пищевых продуктах важное место занимает пробоподготовка, целью которой является наиболее полное извлечение следовых количеств аналита и эффективная очистка от компонентов биологической матрицы.
В статье представлены результаты исследований по выбору оптимальных условий пробоподготовки в ходе разработки методики определения левомицетина в мясных продуктах.
Экспериментальные исследования по отработке условий проводились на жидкостном хроматографе Agilent 1200 в сочетании с масс-спектрометрическим детектором с тройным квадруполем LC/MS 6460 Agilent Technologies в отработанных условиях выполнения анализа.
При выборе оптимальных условий подготовки проб к анализу для получения более точных результатов при проведении количественного анализа органических соединений необходимо учитывать влияние матричного эффекта, степень извлечения и погрешность подготовки проб к анализу, так как они могут в значительной степени повлиять на конечные результаты измерений [1]. С этой целью проведено сравнение эффективности экстракции антибиотика из образцов мясного фарша с использованием различных способов пробоподготовки.
В ходе проделанной работы был исследованы 2 варианта пробоподготовки с использованием метода твердофазной экстракции с насыпными сорбентами. Пробоподготовка основана на методе “QuEChERS”, используемом для определения пестицидов и других контаминантов в продуктах питания.
В первом варианте к 10 г мясного фарша, с заданным содержанием левомицетина, добавляли 20 см3 ацетонитрила и соли, в основном MgSO4 и NaCl, используемые в качестве высаливателей.
Смесь интенсивно встряхивали, центрифугировали при скорости вращения 3000 об/мин. Надосадочный слой отбирали в чистую пробирку объемом 50 см3 и чистили путем добавления в пробирку с экстрактом сорбента и соли MgSO4, интенсивно перемешивали в течение 1 минуты. Смесь центрифугировали в течение 1 мин со скоростью 3000 об/мин, верхний слой переносили в чистую пробирку, высушивали в токе воздуха при нагревании. Сухой остаток перерастворяли в 1 см3 смеси ацетонитрил:вода (1:1), фильтровали через капроновый фильтр с диаметром пор 0,2 мкм и анализировали аликвоту объемом 10 мм3 методом ВЭЖХ/МС.
Для расчета степени экстракции использовали характеристики, полученные для основного иона: площадь (S 321->152) и отношение сигнал/шум (SNR 321->152). Степень экстракции левомицетина составила 33 %.
В отличие от 1-го (безводного) варианта, исключающего присутствие воды, во 2-ом варианте экстракция протекала в водной среде. 2г мясного фарша, с заданным содержанием левомицетина, помещали в центрифужную пробирку вместимостью 50 см3, к образцу добавляли дистиллированную воду (8—10 см3). Смесь интенсивно встряхивали в течение 1 минуты, добавляли 10 см3 1 %-го раствора уксусной кислоты в ацетонитриле, интенсивно встряхивали в течение 5 минут, добавляли набор для ТФЭ с насыпным сорбентом для анализа мясных и молочных продуктов, встряхивали в течение 1 минуты и центрифугировали при скорости вращения 4000 об/мин. Надосадочный слой отбирали в чистую пробирку объемом 15 см3, содержащую сорбент для очистки экстракта, интенсивно встряхивали в течение 2 минут, центрифугировали при скорости вращения 4000 об/мин. Верхний слой растворителя переносили в новую пробирку, высушивали в токе воздуха при температуре 40 оС, перерастворяли в 0,8 см3 раствора метанол/вода/0,1 % уксусная кислота. Экстракт фильтровали через капроновый фильтр и анализировали в количестве 10 мм3 методом ВЭЖХ/МС. Степень экстракции хлорамфеникола из образцов мяса составляет 41,0 %.
Наиболее широко используемым приемом извлечения анализируемых веществ из биологических сред, в том числе продуктов питания, является экстракция [2]. Изучена эффективность извлечения левомицетина из мяса методом жидкостной экстракции с использованием в качестве экстрагента этилацетата. Процедура пробоподготовки заключалась в двойной экстракции 10 г мясного фарша, с заданным содержанием левомицетина, этилацетатом. Объединенные экстракты высушивали в токе воздуха на водяной бане до образования остатка в виде маслянистой капли. К остатку добавляли 2 см3 метанола, 25 см3 4 %-ного водного раствора хлорида натрия и 20 см3 гексана. Содержимое пробирки интенсивно встряхивали и центрифугировали в течение 5 мин со скоростью 3000 об/мин. Верхний (гексановый) слой отбрасывали и проводили повторную очистку гексаном. К оставшемуся раствору добавляли 15 см3 этилацетата, тщательно перемешивали, центрифугировали со скоростью 3000 об/мин. Верхний слой (слой этилацетата) переносили в чистую пробирку, проводили повторную жидкостную экстракцию этилацетатом. Объединенный экстракт высушивали досуха на водяной бане при температуре 45 оС. Остаток растворяли в 1 см3 смеси метанол:вода=1:1, фильтровали через капроновый фильтр и анализировали аликвоту объемом 10 мм3 методом высокоэффективной жидкостной хроматографии с масс-спектрометрическим детектированием (ВЭЖХ/МС).
Степень экстракции левомицетина составила 99,98 %. Результаты анализа представлены в таблице 2.
С целью сравнения эффективности извлечения хлорамфеникола из мясных продуктов различными способами дополнительно проведены исследования по определению хлорамфеникола из продуктов животного происхождения согласно действующим методическим указаниям МУК 4.1.1912-04 «Определение остаточных количеств левомицетина (хлорамфеникола, хлормицетина) в продуктах животного происхождения методом высокоэффективной жидкостной хроматографии и иммуноферментного анализа».
10 г мясного фарша, с заданным содержанием левомицетина, гомогенизировали с 15см3 фосфатного буфера (0,025 М КН2Р04 + 0,025 М Na2НР04) рН = 6,88 и экстрагировали 3 раза по 30 см3 этилацетата. Полученную взвесь центрифугировали 15 мин при 4000 об./мин и декантировали этилацетатный слой, промывали последовательно 5 см3 насыщенного раствора NaС1 с добавлением 0,2 мл 10 %-ного NaОН; 5 мл насыщенного раствора NaС1 с добавлением 0,2 мл 10 %-ного СН3СООН и 5 см3 насыщенного раствора NaС1. Органический слой отбирали и упаривали на ротационном испарителе (при 50 °С) до возможно минимального объема, отдували азотом до исчезновения запаха органических растворителей, добавляли 3 см3 смеси ацетонитрил:вода (1:4) и экстрагировали 3 раза 5 см3 петролейного эфира, петролейный эфир отбрасывали и извлекали хлорамфеникол экстракцией этилацетатом (3 раза по 5 см3). Этилацетатный слой упаривали досуха, растворяли в 0,1 см3 метанола и анализировали аликвотное количество раствора. Степень экстракции хлорамфеникола из образцов мяса составила 56,4 %.
Результаты исследований по определению эффективности извлечения хлорамфеникола методом жидкостной экстракции, твердофазной экстракции с насыпным сорбентом и по методическим указаниям МУК 4.1.1912-04 приведены в таблице 2.
Нужна помощь в написании статьи?
Мы - биржа профессиональных авторов (преподавателей и доцентов вузов). Пишем статьи РИНЦ, ВАК, Scopus. Помогаем в публикации. Правки вносим бесплатно.
Таблица 1.
Сравнение эффективности способов извлечения хлорамфеникола из мясной матрицы
При сравнении полученных результатов установлено, что оптимальным способом экстракции хлорамфеникола из мясных продуктов является жидкостная экстракция с использованием в качестве растворителя-экстрагента этилацетата с последующей очисткой экстракта гексаном. В данном случае достигнута 100 %-ная экстракция хлорамфеникола с учетом матричного эффекта.
Таким образом, в ходе проведенных экспериментальных исследований отработан оптимальный способ подготовки проб мяса к анализу для определения левомицетина методом ВЭЖХ/МС, заключающийся в извлечении левомицетина из мяса жидкостной экстракцией этилацетатом и очисткой экстракта гексаном. Способ характеризуется высокой степенью извлечения, экспрессностью и простотой выполнения. Данный способ пробоподготовки может быть использован при разработке метода определения левомицетина в мясных продуктах.
Список литературы:
1.Онищенко Г.Г. Руководство «Контроль содержания химических соединений и элементов в биологических средах» / Н.В. Зайцева, Т.С. Уланова Пермь: Книжный формат, 2011. — 520 с.
2.Leo M.L. Nollet. Analysis of endocrine disrupting compounds in food. Blackkwell Publishing Ltd, 2001. — 491 p.