Содержание
Введение
1. Понятие о биотехнологии, цели и задачи
2. Отрасли биотехнологии
3. Краткая история развития биотехнологии
4. Микроорганизмы, клетки и процессы, применяемые в биотехнологии
5. Технология получения продуктов микробного или клеточного синтеза
6. Генетическая инженерия и область ее применения в биотехнологии
7. Биологические препараты, полученные методом генетической инженерии из рекомбинантных штаммов микроорганизмов
8. Понятие о гене
9. Методы получения генов
Заключение
Список использованных источников
Введение
Генетическая инженерия – область молекулярной биологии и генетики, которая ставит перед собой задачи конструирования генетических структур по ранее намеченному плану, создание организмов с новой генетической программой. Генно-инженерные исследования вносят уникальный вклад в изучение структурно-функциональной организации геномов различных организмов. Методология генной инженерии постоянно совершенствуется, и все больше исследователей используют ее при решении самых разных задач биологической науки.
Возможности, открываемые генетической инженерией перед человечеством, как в области фундаментальной науки, так и во многих других областях, весьма велики и нередко даже революционны. Так, она позволяет осуществлять индустриальное массовое производство нужных белков, значительно облегчает технологические процессы для получения продуктов ферментации – энзимов и аминокислот, в будущем может применяться для улучшения растений и животных, а также для лечения наследственных болезней человека.
Таким образом, генетическая инженерия, будучи одними из магистральных направлений научно-технического прогресса, активно способствуют ускорению решения многих задач, таких, как продовольственная, сельскохозяйственная, энергетическая, экологическая.
Но особенно большие возможности генетическая инженерия открывает перед медициной и фармацевтикой, поскольку ее применение может привести к коренным преобразованиям медицины. Многие болезни, для которых в настоящее время не существует адекватных методов диагностики и лечения (раковые, сердечнососудистые, вирусные и паразитные инфекции, нервные и умственные расстройства), с помощью генетической инженерии станут доступны и диагностике, и лечению.
1. Понятие о биотехнологии, цели и задачи
Биотехнология представляет собой область знаний, которая возникла и оформилась на стыке микробиологии, молекулярной биологии, генетической инженерии, химической технологии и ряда других наук. Рождение биотехнологии обусловлено потребностями общества в новых, более дешевых продуктах Рождение биотехнологии обусловлено потребностями общества в новых, более дешевых продуктах для народного хозяйства, в том числе медицины и ветеринарии, а также в принципиально новых технологиях.
Биотехнология (от греч. bios – жизнь, teken – искусство, мастерство, logos – наука, умение, мастерство) – это получение продуктов из биологических объектов или с применением биологических объектов. В качестве биологических объектов могут быть использованы организмы животных и человека (например, получение иммуноглобулинов из сывороток вакцинированных лошадей или людей; получение препаратов крови доноров), отдельные органы (получение гормона инсулина из поджелудочных желез крупного рогатого скота и свиней) или культуры тканей (получение лекарственных препаратов). Однако в качестве биологических объектов чаще всего используют одноклеточные микроорганизмы, а также животные и растительные клетки. Выбор этих
объектов обусловлен следующими причинами:
- клетки являются своего рода «биофабриками», вырабатывающими в процессе жизнедеятельности разнообразные ценные продукты (белки, жиры, углеводы, витамины, аминокислоты, антибиотики, гормоны, антитела, антигены, ферменты, спирты и пр.). Эти продукты, крайне необходимые в жизни человека, пока недоступны для получения «небиотехнологическими» способами из-за сложности технологии процессов или экономической нецелесообразности, особенно в условиях крупномасштабного производства;
- клетки чрезвычайно быстро воспроизводятся, что позволяет за относительно короткое время искусственно нарастить на сравнительно дешевых и недефицитных питательных средах в промышленных масштабах огромные количества биомассы микробных, животных или растительных клеток;
- биосинтез сложных веществ (белков, антибиотиков, антигенов, антител и др.) значительно экономичнее и технологически доступнее, чем химический синтез. Коэффициент полезного действия «работы» клетки равен 70 %, а самого совершенного технологического процесса – значительно ниже;
- возможность проведения биотехнологического процесса в промышленных масштабах, т.е. наличие соответствующего технологического оборудования и аппаратуры, доступность сырья, технологии переработки и др.
Клетки животных и растений, микробные клетки в процессе жизнедеятельности (ассимиляции и диссимиляции) образуют новые продукты и выделяют метаболиты, обладающие разнообразными физико-химическими свойствами и биологическим действием. Обычно продукты
жизнедеятельности одноклеточных делят на 4 категории:
- сами клетки как источник целевого продукта. Например, выращенные бактерии или вирусы используют для получения живой или убитой корпускулярной вакцины; дрожжи . как кормовой белок или основу для получения гидролизатов питательных сред и т.д.;
- крупные молекулы (макромолекулы), которые синтезируются клетками в процессе выращивания: ферменты, токсины, антигены, антитела, пептидогликаны и др.;
- первичные метаболиты . низкомолекулярные вещества, необходимые для роста клеток (аминокислоты, витамины, нук-леотиды, органические кислоты);
- вторичные метаболиты (идиолиты) . низкомолекулярные соединения, не требующиеся для роста клеток (антибиотики, алкалоиды, токсины, гормоны).
2. Отрасли биотехнологии
Биотехнология использует эту продукцию клеток как сырье, которое в результате технологической обработки превращается в конечный продукт. С помощью биотехнологии получают множество продуктов, используемых в различных отраслях:
- медицине (антибиотики, витамины, ферменты, аминокислоты, гормоны, вакцины, антитела, компоненты крови, диагностические препараты, иммуномодуляторы, алкалоиды, пищевые белки, нуклеиновые кислоты, нуклеозиды, нуклеотиды, липиды, антиметаболиты, антиоксиданти, противоглистные и противоопухолевые препараты);
- ветеринарии и сельском хозяйстве (кормовой белок: кормо-1 вые антибиотики, витамины, гормоны, вакцины, биологические средства защиты растений, инсектициды);
- пищевой промышленности (аминокислоты, органические кислоты, пищевые белки, ферменты, липиды, сахара, спирты, дрожжи);
- химической промышленности (ацетон, этилен, бутанол);
- энергетике (биогаз, этанол).
Следовательно, биотехнология направлена на создание диагностических, профилактических и лечебных медицинских и ветеринарных препаратов, на решение продовольственных вопросов (повышение урожайности, продуктивности животноводства, улучшение качества пищевых продуктов – молочных, кондитерских, хлебобулочных, мясных, рыбных); на обеспечение многих технологических процессов в легкой, химической и других отраслях промышленности. Необходимо отметить также все возрастающую роль биотехнологии в экологии, так как очистка сточных вод, переработка отходов и побочных продуктов, их деградация (фенол, нефтепродукты и другие вредные для окружающей среды вещества) осуществляются с помощью микроорганизмов.
В настоящее время в биотехнологии выделяют медико-фармацевтическое, продовольственное, сельскохозяйственное и экологическое направления. В соответствии с этим биотехнологию можно разделить на медицинскую, сельскохозяйственную, промышленную и экологическую. Медицинская в свою очередь подразделяется на фармацевтическую и иммунобиологическую, сельскохозяйственная – на ветеринарную и биотехнологию растений, а промышленная – на соответствующие отраслевые направления (пищевая, легкая промышленность, энергетика и т.д.).
Биотехнологию также подразделяют на традиционную (старую) и новую. Последнюю связывают с генетической инженерией. Общепризнанное определение предмета «биотехнология» отсутствует и даже ведется дискуссия о том, наука это или производство.
Нужна помощь в написании реферата?
Мы - биржа профессиональных авторов (преподавателей и доцентов вузов). Наша система гарантирует сдачу работы к сроку без плагиата. Правки вносим бесплатно.
Видимо, правильно будет определить биотехнологию как сферу деятельности, которая на основе изучения процессов жизнедеятельности живых организмов, главным образом клеток микроорганизмов, животных и растительных клеток, использует эти процессы и сами объекты для промышленного производства продуктов, необходимых в жизни человека, а также получения биоэффектов, ранее не встречавшихся в природе (например, получение рекомбинантных бактерий, трансгенных растений и животных).
В биотехнологии, как в никакой другой области знаний, тесно увязываются, интегрируются наука и производство.
3. Краткая история развития биотехнологии
Биотехнология возникла в древности (примерно 6000 – 5000 лет До н.э.), когда люди научились выпекать хлеб, варить пиво, приготовлять сыр и вино. Этот первый этап развития биотехнологии был сугубо эмпирический и продолжал оставаться таким, несмотря на совершенствование технологических процессов и расширение сфер использования биотехнологических приемов, вплоть до открытия Л.Пастером в XIX в. природы процесса брожения. С этого момента начался второй научный этап традиционной биотехнологии. В этот период получены и выделены ферменты, открыты многие микроорганизмы; разработаны способы их выращивания в массовых количествах; получены культуры животных и растительных клеток и разработаны способы искусственного их культивирования; в результате изучения физиологии, биохимии и генетики микробных и животных клеток получены многие продукты микробиологического синтеза, необходимые для медицины, сельского хозяйства и промышленности. Сформировалась вначале техническая микробиология, а затем биотехнология. Однако промышленное производство сводилось в основном к получению продуктов на основе природных штаммов.
На смену старой традиционной биотехнологии пришла новая биотехнология, основанная на применении искусственно получаемых штаммов – суперпродуцентов, использовании иммобилизованных ферментов, применении культур животных и растительных клеток, широком использовании генетической инженерии для получения клеток-рекомбинантов, моноклональных антител и других биологически активных веществ.
Новая биотехнология возникла, таким образом, на основе : достижений молекулярной биологии и микробиологии, генети- 1 ки и генетической инженерии, иммунологии и химической технологии. Основой ее явилась генетическая инженерия, индустрия рекомбинантных ДНК.
4. Микроорганизмы, клетки и процессы, применяемые в биотехнологии
В природе существует огромное число микроорганизмов. Все они способны синтезировать продукты или осуществлять реакции, которые могут быть полезны для биотехнологии. Однако практическое применение нашли не более 100 видов микроорганизмов (бактерии, грибы, дрожжи, вирусы, водоросли), так как остальные мало изучены.
Дрожжи широко используют в хлебопечении, пивоварении, виноделии, получении соков, кормового белка, питательных сред для выращивания бактерий и культур животных клеток. Из 500 известных видов дрожжей используется только несколько видов – Saccharomyces cerevisiae, Saccharomyces carlsbergencis, Saccharomyces uwarum.
Среди бактерий чаще всего применяют в биотехнологии представителей следующих родов: Acetobacter, которые превращают этанол в уксусную кислоту и уксусную кислоту в углекислый газ и воду; Bacillus – для получения ферментов (В. subtilis), средств защиты растений (В. thuringiensis); Clostridium – для сбраживания сахаров в ацетон, этанол, бутанол; молочнокислые бактерии (Lactobacillus, Leuconostoc, Streptococcus); псевдомонады – например P. Denitrificans – для получения витамина В12, Corynebacterium glutamatum – для получения аминокислот и др.
Для получения разнообразных антибиотиков в биотехнологии применяют актиномицеты (род Streptomyces), грибы Penicillium chrysogenum, Cephalosporium acremonium и др.
Многие микроорганизмы – бактерии, дрожжи, вирусы – используют в качестве реципиентов чужеродного генетического материала с целью получения рекомбинантных штаммов – продуцентов биотехнологической продукции. Получены рекомбинантные штаммы Е. coli, продуцирующие интерфероны, инсулин, гормон роста, антигены вируса СПИДа; штаммы В. subtilis, вырабатывающие интерферон; штаммы дрожжей, продуцирующих интерлейкин-2, антиген вируса гепатита В; рекомбинантные вирусы осповакцины, синтезирующие антигены гепатита В, вируса бешенства, клещевого энцефалита и др.
Для получения вакцин и диагностических препаратов используют также патогенные микроорганизмы (брюшного тифа, коклюша, дифтерии, столбняка и др.).
Широкое применение в биотехнологии нашли культуры животных и растительных клеток. Известно, что строение, физиология и биотехнология животных и растительных клеток более сложны, чем бактериальных клеток. Из культур животных и растительных клеток можно извлечь более широкий ассортимент сложной и ценной продукции, однако процесс культивирования растительных и животных клеток более трудоемкий и дорогостоящий. Из культур тканей растений можно получать разнообразные соединения, используемые в медицине (алкалоиды, противовоспалительные вещества, противолейкозные и противоопухолевые, противобактериальные, сердечные и почечные средства, ферменты, витамины, опиаты и др.), сельском хозяйстве, химической и других отраслях промышленности. Животные клетки используют как для получения продукции, синтезируемой клетками, так и для выращивания в клетках вирусов с целью получения из них вакцин и диагностических препаратов.
5. Технология получения продуктов микробного или клеточного синтеза
Основным условием для успешного проведения технологического процесса является выбор или получение высокопродуктивного промышленного штамма-продуцента и поддержание его в активном состоянии. Известно, что различные штаммы по количеству и качеству продукции того или иного вещества (фермента, антибиотика, витамина, аминокислоты, антигена, алкалоида и др.) могут существенно отличаться. Естественно, что от этого в значительной мере зависят экономическая эффективность и активность целевого продукта.
Вторым важным условием является подбор питательных сред, обеспечивающих максимальное накопление биомассы или целевого продукта; питательные среды должны состоять из дешевого, недефицитного и доступного сырья, поскольку при промышленном культивировании микроорганизмов потребляются огромные их количества. В крупномасштабном производстве для приготовления питательных сред служит обычно сравнительно дешевое сырье (меласса, парафины нефти, дрожжи, уксусная кислота, природный газ). Более ограниченное применение, главным образом при получении медицинских препаратов, находят казеин, препараты крови, среды из мясных гидролизатов.
Для выращивания животных клеток применяют питательные среды, имеющие сложный состав. Они компануются из высококачественного сравнительно дорогого сырья (аминокислоты, соли, ростовые факторы). В последнее время успешно разрабатываются питательные среды для культур клеток из гидролизатов казеина, дрожжей, мяса и крови.
Для получения продукции в максимальных количествах активный штамм-продуцент выращивают на оптимальной питательной среде в оптимальных условиях культивирования (посевная доза, температура, рН, окислительно-восстановительный потенциал, аэрация, массообменные характеристики, питательные и ростовые добавки, сроки культивирования). Выращивание проводят в ферментаторах (культиваторах), вместимость которых может варьировать от 2 л до 100 – 400 м3 в зависимости от потребности в продукте. Для получения культур животных клеток объем ферментаторов пока не превышает 3 м3. В настоящее время биотехнологическая промышленность оснащена ферментаторами, позволяющими вести процесс в автоматическом режиме с программным управлением. Процесс культивирования ведется в асептических условиях, чтобы получить чистые культуры целевых микроорганизмов или культуры клеток.
Помимо суспензионного (глубинного) культивирования в ферментаторах иногда применяют поверхностное культивирование на плотных питательных средах (бактерии, грибы) или в жидком монослое (культуры животных клеток). Последний способ осуществляется в роллерных (вращающихся) установках. Полученную биомассу микроорганизмов или культуры клеток подвергают затем переработке, сущность которой определяется технологией получения целевого продукта. Наиболее типовыми являются следующие процессы:
- концентрирование биомассы (сепарированием, центрифугированием) и приготовление из него жидкого (суспензии, пасты) или сухого продукта;
- высушивание, которое проводится лиофильным способом из замороженного состояния или путем распыления в потоке теплого воздуха. Для этого существуют специальные лиофильные аппараты (в том числе ленточные автоматические сушилки большой мощности) и распылительные сушилки, в том числе экологически чистые, так как процесс ведется в замкнутом цикле. Последние имеют большую мощность, однако не позволяют сушить термолабильные продукты;
- сбор центрифугата после отделения биомассы и выделения из него целевого продукта, например антигенов, токсинов, инсулина и др. Иногда предварительно прибегают к дезинтеграции (разрушению) клеток механическим способом или с помощью ультразвука, осмоса, чтобы увеличить выход целевого продукта.
В тех случаях, когда из биомассы или центрифугата (культу-ральная жидкость) необходимо выделить активную субстанцию – витамин, аминокислоту, антиген, антитело, фермент и пр., применяют физические или физико-химические методы очистки. Выбор их определяется свойствами выделяемого вещества (природа, молекулярная масса, лабильность к внешним воздействиям, химическое сродство и т. д.). Из физических методов чаще всего применяют на первичных стадиях сепарирование, центрифугирование (ультрацентрифугирование), а из физико-химических – осаждение нейтральными солями, спиртом, ацетоном, а также ультрафильтрацию, хроматографию, электрофорез. Методы выделения и очистки, как правило, многоступенчатые. Чистоту получаемого продукта характеризуют наличием в нем примесей и выражают коэффициентом очистки, который представляет отношение числа активных единиц продуктов на 1 мг белка или азота (так называемая удельная активность) в очищенном препарате к удельной активности исходного (неочищенного) продукта.
Обычно в препаратах активная субстанция не всегда находится в предельно очищенном состоянии, поскольку в производственных условиях при переработке больших объемов сырья и существующих методах очистки этого добиться пока не удается. Поэтому иммунобиологические препараты, полученные как традиционным методом, так и способом генетической инженерии, содержат, как правило, примеси питательных сред, на которых выращивали микроорганизмы, а также продукты метаболизма и неспецифические компоненты – продукты распада микробной клетки. К примесям относятся белки, полисахариды и их комплексы, нуклеиновые кислоты, соли и другие низкомолекулярные вещества. Они не только бесполезны для препаратов, но иногда вызывают нежелательные побочные реакции организма при применении препаратов (местные реакции, повышение температуры тела, аллергические проявления). В принципе необходимо стремиться к получению препаратов, содержащих активную субстанцию в предельно очищенном состоянии.
После получения активной субстанции из нее конструируют конечный препарат. В соответствии с назначением и способом применения он может быть в жидком или сухом состоянии (раствор, суспензия, порошок) или в виде мазей. Препарат может быть предназначен для наружного, парентерального или энтерального, аэрозольного применения. В зависимости от этого препарат может быть стерильным и нестерильным.
Конечный препарат обычно содержит, помимо примесей, от которых не удалось освободиться, необходимые добавки: консервант (антисептик для поддержания стерильности препарата при хранении), стабилизатор (обычно инертные белки, аминокислоты для повышения устойчивости лабильного активного начала при хранении), активаторы (например, адъюванты и иммуномодуля-торы в вакцинах). В конечной композиции препарат фасуется (ампулы, флаконы, таблетки, мази), этикетируется, снабжается инструкцией по применению.
Каждая серия препарата проходит стандартизацию в соответствии с технической документацией (технические условия, технологический регламент на изготовление) на производстве и в Государственном институте стандартизации и контроля медицинских биологических препаратов им. Л. А. Тарасевича или в Фармакологическом комитете в зависимости от назначения препарата.
6. Генетическая инженерия и область ее применения в биотехнологии
Генетическая инженерия является основой биотехнологии. Генетическая инженерия по существу сводится к генетической рекомбинации, т.е. обмену генами между двумя хромосомами, которая приводит к возникновению клеток или организмов с двумя и более наследственными детерминантами (генами), по которым родители различались между собой.
Метод рекомбинации заключается в следующем:
- выделение ДНК из разных видов организмов или клеток; А получение гибридных молекул ДНК;
- введение рекомбинантных (гибридных) молекул в живые клетки;
- создание условий для экспрессии и секреции продуктов, кодируемых генами.
Гены, кодирующие те или иные структуры, выделяются (клонируются) из хромосом или плазмид, прицельно выщепляются из этих генетических образований с помощью ферментов рестрикцииили синтезируются химически. Набор ферментов (известно более 500 рестриктаз), способных резать ДНК по определенным связям (сайтам), является важным инструментом генетической инженерии. В последнее время обнаружены ферменты, расщепляющие по определенным связям РНК наподобие рестрикции ДНК. Эти ферменты названы рибозимами. Их роль еще пока не выяснена.
С помощью химического синтеза могут быть получены сравнительно небольшие гены. Для этого вначале расшифровывают число и последовательность аминокислот в белковой молекуле вещества и по этим данным узнают очередность нуклеотидов в гене, поскольку каждой аминокислоте соответствуют три нуклеотида (кодон). С помощью синтезатора создают химическим путем ген, аналогичный природному гену.
Полученный целевой ген с помощью ферментов лигаз сшивают с другим геном, который используют в качестве вектора для встраивания гибридного гена в клетку. В качестве вектора могут служить плазмиды, бактериофаги, вирусы человека, животных, растений.
Количество плазмид в бактериальной клетке может колебаться от одной до нескольких сотен, причем чем большие размеры имеет плазмида, тем меньше ее копий в клетке. С помощью амплификации генов, т.е. увеличения числа копий определенного гена в клетке, можно резко повысить производство кодируемого вещества клеткой. Амплификацией удается добиться получения до 3000 копий плазмидных генов на клетку.
Бактериофаг как вектор используется аналогично. Целевой ген встраивается в геном фага, реплицируется вместе с генами вируса при размножении последнего в бактериальной клетке. Чаще всего используется фаг ламбда, который содержит ДНК, состоящую из 50 тыс. пар нуклеотидов. Преимущество фага ламбда перед плазмидами в том, что фаговый вектор позволяет клонировать большие фрагменты чужеродной ДНК.
В случае использования в качестве векторов вирусов человека, животных и растений чужеродный ген встраивают в ДНК вируса, и он реплицируется вместе с размножением последнего в клетке. Применяют в качестве вектора космиды, представляющие собой гибрид плазмиды с фагом. Космиды используют для клонирования больших (до 45 тыс. пар нуклеотидов) фрагментов ДНК эукариот.
Для РНК-содержащих вирусов передача генетической информации возможна с помощью ревертазы (обратной транскриптазы), передающей информацию о структуре белка от РНК к ДНК, которая является комплементарной иРНК.
Нужна помощь в написании реферата?
Мы - биржа профессиональных авторов (преподавателей и доцентов вузов). Наша система гарантирует сдачу работы к сроку без плагиата. Правки вносим бесплатно.
На рис.1 показана принципиальная схема получения рекомбинантных молекул ДНК и рекомбинантных бактерий. Экспрессируемый ген в виде рекомбинантной ДНК (плазмида, фаг, космида, вирусная ДНК) встраивается в бактериальную или животную клетку, которая приобретает новое свойство – способность продуцировать не свойственное этой клетке вещество, кодируемое экспрессируемым геном. Для лучшего проникновения вектора через стенку бактерий иногда прибегают к воздействию на стенку (например, хлоридом кальция), чтобы увеличить ее проницаемость.
В качестве реципиентов экспрессируемого гена чаще всего используют Е. coli, В.subtilis, псевдомонады, дрожжи, вирусы. Реципиента подбирают не только с учетом возможности встройки чужеродного гена, но и уровня выраженности (экспрессии) синтеза вещества, кодируемого геном, возможности его секреции в окружающую среду, легкости и доступности массового культивирования, экологической безопасности. Некоторые штаммы рекомбинантных бактерий способны переключать на синтез чужеродного вещества, экспрессируемого геном, до 50 % своего синтетического потенциала. Такие штаммы – суперпродуценты целевых продуктов – уже получены и применяются в биотехнологической промышленности; они носят название промышленных штаммов. В качестве примера можно привести штаммы – суперпродуценты интерферона, интерлейкина, белков ВИЧ и др.
Некоторые штаммы микроорганизмов хорошо экспрессируют чужеродные гены, но плохо секретируют продукт в окружающую среду, в таких случаях приходится применять дезинтеграцию (разрушение) клетки с целью высвобождения из нее синтезированного продукта.
В некоторых случаях, несмотря на наличие экспрессии и секреции, продукт не удается получить, вернее собрать, из-за разрушения в процессе синтеза или после него протеазами и другими ингибиторами. Это прежде всего относится к низкомолекулярным пептидам.
С целью повышения уровня секреции целевого белка пользуются следующим приемом: к гену целевого белка присоединяют ген белка, хорошо секретируемого клеткой реципиента. Образующийся в результате такой манипуляции химерный белок, хорошо секретируемый клеткой, собирают и от него отщепляют целевой белок. Возможно также к гену целевого белка присоединить ген-индикатор, т. е. ген, кодирующий легко узнаваемый белок, в результате чего получают химерный индикаторный белок, а из него – целевой белок. В качестве индикатора можно использовать, например, галактозидазу.
7. Биологические препараты, полученные методом генетической инженерии из рекомбинантных штаммов микроорганизмов
Из многих сотен препаратов, полученных методом генетической инженерии, в практику внедрена только часть: интерфероны, интерлейкины, фактор VIII, инсулин, гормон роста, тканевый активатор плазминогена, вакцина против гепатита В, моноклональные антитела для предупреждения отторжения при пересадках почки, диагностические препараты для выявления ВИЧ и др. Это обстоятельство можно объяснить несколькими причинами. Во-первых, длительное время к этим препаратам и рекомбинантным штаммам микроорганизмов относились настороженно, опасаясь, что может произойти неуправляемое распространение экологически опасных рекомбинантных микроорганизмов. Однако в наши дни эти опасения практически сняты. Во-вторых, использование рекомбинантных штаммов продуцентов предусматривает разработку сложных технологических процессов по получению и выделению целевых продуктов. На разработку технологии получения препаратов методом генетической инженерии, доклинические и клинические испытания их обычно затрачивается значительно больше средств, чем на получение штамма. В-третьих, при получении препаратов методом генетической инженерии всегда возникает вопрос об идентичности активной субстанции, вырабатываемой рекомбинантным штаммом-продуцентом, природному веществу, т. е. требуется проведение исследовательских работ, направленных на доказательство идентичности, а также иногда решение дополнительных задач по приданию продукту природного характера.
Таблица 1: Медицинские препараты, разрабатываемые методами современной биотехнологии
Однако метод генетической инженерии относится к числу перспективнейших при получении многих белковых биологических веществ, представляющих ценность для медицины. В области создания биологически активных веществ медицинского назначения с помощью метода генетической инженерии исследования продолжаются на следующем этапе . создаются препараты второго поколения, т. е. аналоги природных веществ, обладающих большей эффективностью действия.
При определении целесообразности и экономичности методов генетической инженерии для получения медицинских или других препаратов по сравнению с традиционными способами учитываются многие обстоятельства, в первую очередь доступность этого метода, экономичность его, качество получаемого препарата, новизна, безопасность проведения работ и др.
Метод генетической инженерии является единственным при получении препаратов, если природный микроорганизм или животные и растительные клетки не культивируются в промышленных условиях. Например, возбудитель сифилиса или малярийный плазмодий практически не растет на искусственных питательных средах. Поэтому для получения диагностических препаратов или вакцин прибегают к клонированию или синтезу генов протективных антигенов, их встраиванию в легко культивируемые бактерии. При выращивании этих рекомбинантных бактерий-реципиентов получают нужные антигены, на основе которых создают диагностический препарат или вакцину. Таким образом, уже производится вакцина против гепатита В. Ген HBs-антигена вируса гепатита встроен в дрожжевую клетку; при выращивании дрожжей образуется HBs-антиген, из которого готовят вакцину.
Метод генетической инженерии предпочтительнее также в том случае, когда микроорганизм высоко патогенен и опасен при промышленном производстве. Например, для получения из ВИЧ диагностических препаратов и вакцин предпочитают не выращивать вирус в больших количествах, а необходимые антигены получают методом генетической инженерии. К настоящему времени практически все основные антигены ВИЧ (р24, gp41, gp120 и др.) получены путем выращивания рекомбинантных штаммов Е. coli или дрожжей, способных продуцировать эти антигены. На основе рекомбинантных белков уже созданы диагностические препараты для обнаружения СПИДа.
Метод генетической инженерии используют в том случае, когда исходное сырье для получения препарата традиционным способом является дефицитным или дорогостоящим. Например, лейкоцитарный α-интерферон получают из лейкоцитов донорской крови человека. Из 1 л крови получают 2-3 дозы высоко-концентрированного интерферона. На курс лечения онкологического больного требуются сотни доз препарата. Следовательно, массовое производство и применение лейкоцитарного интерферона из крови нереально. Производство лейкоцитарного интерферона методом генетической инженерии значительно экономичнее и не требует дефицитного сырья (крови). Его получают путем выращивания рекомбинантных штаммов бактерий (Е. coli, псевдомонад), способных продуцировать интерферон в результате встройки им гена α-интерферона. Из 1 л культуры рекомбинантных бактерий получают 100-150 доз лейкоцитарного интерферона с активностью 106 ME.
Получение природного инсулина — гормона для лечения диабета, основанное на извлечении его из поджелудочных желез крупного рогатого скота и свиней, сдерживается дефицитом сырья. Кроме того, гормон имеет животное происхождение. Разработанный генетической инженерией метод получения человеческого инсулина путем выращивания рекомбинантного штамма Е. coli решил проблему обеспечения больных этим жизненно важным препаратом. Такая же ситуация наблюдается и в отношении гормона роста человека, получаемого из гипофиза умерших людей. Этого гормона не хватало для лечения карликовости, быстрейшего заживления ран и т.д. Генетическая инженерия решила эту проблему: достаточно 1000 л культуры рекомбинантного штамма Е. coli, чтобы получить количество гормона, достаточное для лечения карликовости, например, в такой большой стране, как США.
Большую группу иммуноцитокинов эндогенного происхождения, играющих большую роль в регуляции иммунитета, кооперации иммунокомпетентных клеток и в связи с этим используемых для лечебных и профилактических целей при иммунодефицитах, опухолях, нарушениях работы иммунной системы, получают главным образом методом генетической инженерии, поскольку этот метод эффективнее традиционного. К иммуноцитокинам относят интерлейкины (насчитывают 18 разновидностей: ИЛ-1, ИЛ-2… ИЛ-18), миелопептиды, факторы роста, гормоны вилочковой железы. Все они являются пептидами, вырабатываемыми иммунокомпетентными клетками, и обладают биологическим действием, влияют на пролиферацию, дифференцировку или физиологическую активность иммунокомпетентных и других клеток (Т- и В-лимфоцитов, макрофагов). Иммуноцитокины получают путем культивирования клеток (лимфоцитов, макрофагов и др.) на искусственных питательных средах. Однако процесс этот сложен, продукция иммуноцитокинов незначительна и не имеет практического значения. Поэтому для получения иммуноцитокинов применяют метод генетической инженерии. Уже созданы рекомбинантные штаммы Е. coli и другие штаммы, продуцирующие интерлейкины (ИЛ-1, 2, 6 и др.), фактор некроза опухолей, фактор роста фибробластов и др. Это значительно ускорило процесс внедрения иммуноцитокинов в практику.
Метод генетической инженерии используется для получения принципиально новых продуктов и препаратов, не существующих в природе. Например, только с помощью генетической инженерии можно получить рекомбинантные поливалентные живые вакцины, несущие антигены нескольких микроорганизмов. Получен рекомбинантный штамм вируса оспенной вакцины, продуцирующий HBs-антиген вируса гепатита В, бешенства, клещевого энцефалита. Такие живые вакцины называют векторными.
Метод генетической инженерии позволяет также заменить ‘ многие методы, основанные на получении продуктов in vivo, на способы получения этих продуктов in vitro. До последнего времени диагностические, лечебные и профилактические сыворотки получали из крови иммунизированных лошадей или вакцинированных людей-доноров. В настоящее время этот дорогой и, непростой способ вытесняется гибридомной техникой получения антител. Эта техника основана на получении клеток-гибридом путем слияния В-лимфоцитов, взятых от иммунизированных животных и миеломных (раковых) клеток. Образующаяся гибридная клетка (гибридома) обладает способностью миеломной клетки быстро размножаться на искусственных питательных средах и продуцировать при этом антитела (так же, как В-лимфоцит) к антигену, использованному для иммунизации.
Гибридомы, продуцирующие антитела, могут выращиваться в больших масштабах в культиваторах или специальных аппаратах. Поскольку образующиеся гибридомой антитела Іпроизошли от одной родоначальной клетки (В-лимфоцита), то они называются моноклональными антителами. Моноклональные антитела широко используются для создания диагностических препаратов, а также в некоторых случаях применяются с лечебной целью (в онкологии).
Многие фармакологические средства до сих пор получают путем переработки лекарственных трав. Для этого необходимо организовать сбор этих трав или выращивать их на плантации. Биотехнология и генетическая инженерия позволяют получать эти же природные фармакологические вещества путем выращивания в промышленных условиях культур клеток лекарственных растений. В настоящее время налажен выпуск таким способом десятков лекарственных средств, среди них женьшень, строфантин и др.
8. Понятие о гене
Ген (от греч. genos-род, происхождение), участок молекулы ДНК (в неоторых случаях РНК), в котором закодирована информация о биосинтезе одной полипептидной цепи с определенной аминокислотной последовательностью. Ген – единица наследственного материала, обеспечивающая формирование какого-либо признака организма и его передачу в ряду поколений. Контролируют все клеточные процессы на молекулярном уровне, обеспечивая биосинтез белков, в первую очередь ферментов. Если белок состоит из более чем одной полипептидной цепи, синтез каждой из них контролируется самостоятельным геном.
Для гена характерна определенная последовательность нуклеотидов, образующих набор триплетов. Последние определяют порядок расположения аминокислот в молекуле белка. Сам ген не принимает непосредственного участия в его синтезе. ДНК служит лишь матрицей для построения (транскрибирования) молекулы матричной, или информационной, РНК, в которую передается код гена. В рибосомах осуществляется «перевод» кода мРНК в аминокислотную последовательность синтезируемого на них белка (трансляция). Благодаря биологическому действию синтезируемых белков осуществляется экспрессия гена, т.е. развитие определяемого им признака.
Ген функционирует в клетке в составе генной регуляторной системы. В зависимости от выполняемой функции различают структурные гены, кодирующие большое число белков клетки, и регуляторные, ответственные за синтез белков-регуляторов, контролирующих активность структурных генов. Механизм генетического контроля синтеза белка окончательно не выяснен. Предполагают, что у бактерий значительная часть генов объединена в группы, контролирующие отдельные метаболические пути (серии взаимосвязанных обменных реакций) и образующие единые функциональные блоки.
У бактерий гены содержатся в одной хромосоме и автономных генетических элементах — плазмидах и эписомах, представляющих собой замкнутые кольцевые молекулы ДНК. В отличие от плазмид, эписомы могут встраиваться в хромосомы и покидать их. Размер плазмид необычайно широко варьирует. Некоторые из них содержат 1-3 гена, тогда как размеры других составляют 10-20% от величины хромосомы и содержат сотни генов. В плазмидах расположены гены, обеспечивающие устойчивость бактерий к антибиотикам.
Бактериальные гены состоят в среднем из 900-1500 нуклеотидов, расположенных линейно. Молекулярная масса среднего по размеру гена для различных микроорганизмов колеблется в пределах от 0,5*106 до 1*106 .
Термин «ген» впервые предложил В. Иогансен в 1909 для обозначения дискретных наследственных факторов, открытых Г. Менделем в 1865. Значительный прогресс в изучении тонкой структуры и закономерностей функционирования генов связан с развитием методов генетической инженерии, позволяющих выделять индивидуальные гены и получать их в препаративных количествах. Разработка способов расшифровки первичной структуры РНК, а позднее и ДНК, а также познание основных механизмов биосинтеза нуклеиновых кислот в клетке открыли возможность искусственного синтеза генов.
9. Методы получения генов
Химический синтез
Расшифровав последовательность аминокислот в белке, и используя генетический код, определяют последовательность нуклеотидов ДНК на участке гена и производят его синтез из нуклеотидов при помощи фермента полимераза-1. Таким путем в 1969 г. Корана впервые синтезировал участок молекулы ДНК, кодирующий аланиновую т-РНК, а в 1977 г. Бойер синтезировал ген соматостатина человека, а затем и ген инсулина. В 1977 г. В. Гилбертом, а также Ф. Сэнгером был предложен метод секвенирования, т.е. распознавания последовательности нуклеотидов в фрагментах нуклеиновых кислот. Метод химического синтеза генов оказался трудоемким и малоэффективным. Затем появились быстрые и простые методы синтеза сравнительно длинных олигонуклеотидов с определенной, заранее заданной, последовательностью нуклеотидов. Теперь довольно легко можно синтезировать последовательность до 100 нуклеотидов. Автоматизация этих процессов еще более облегчает и ускоряет синтез.
Рестрикционный метод
Специфические эндонуклеазы – рестриктазы – были открыты в 1953 г. у бактерий. С помощью рестриктаз расщепляют ДНК бактерий другого штамма или клетки-хозяина. К настоящему времени из разных микроорганизмов выделено более тысячи различных рестриктаз; в генетической инженерии используется около 200. Рестриктазы гидролизируют ДНК строго по определенным специфическим последовательностям, называемым сайтами рестрикции. Каждая из рестриктаз узнает свой сайт рестрикции и разрезает ДНК либо внутри сайта, либо в непосредственной близости от него. Обозначение растриктаз складывается из начальных букв латинского названия вида бактерии, из которой выделен фермент, и дополнительного обозначения, т.к. из бактерий одного вида может быть выделено несколько различных рестриктаз: Escherichia coli – Eco R1, Eco RV; Thermus aguaticus – Tag 1. Из нескольких типов рестриктаз в генной инженерии часто используются рестриктазы двух типов, которые узнают определенную последовательность ДНК и гидролизуют ее внутри последовательности сайта рестрикции.
Фрагменты ДНК, имеющие одинаковые «липкие» концы, могут соединяться друг с другом с помощью ДНК-лигазы, при этом сайт рестрикции восстанавливается. Фрагменты с «липкими» концами наиболее удобны для создания рекомбинантных ДНК.
Однако рестриктазы не «выстригают» полностью ген и его нужно либо достраивать химическим путем, либо отщеплять лишние нуклеотидные последовательности.
Ферментативный синтез генов
Ферментативный синтез генов стал возможен после открытия фермента обратной транскриптазы или ДНК-ревертазы (Г. Тёмин, Мизутани, 1970), выделенной из онкогенных вирусов. Ревертазы могут синтезировать комплементарную цепь ДНК (к-ДНК) на РНК-матрице. При помощи ДНК-зонда (одноцепочечная меченая молекула ДНК, комплементарная какому-либо участку и-РНК) находят информационную (матричную) РНК. Практически все эукариотические и-РНК содержат на своем 3′ конце последовательность, состоящую из остатков аденина (поли А-последовательность), которая присоединяется к и-РНК в результате сплайсинга. Для начала реакции синтеза ДНК-ревертазе нужна затравка в виде небольшого двухцепочечного отрезка. Эту функцию выполняют короткие олигонуклеотиды из 18-20 тиминовых остатков (поли д-Т), которые соединяются по принципу комплементарности с поли А-последовательностью и-РНК. В результате образуется гибридная и-РНК – к-ДНК молекула, причем на конце у нее будет синтезироваться короткий отрезок двухцепочечной ДНК – шпилька. Шпилька служит затравкой для синтеза второй комплементарной цепи ДНК, осуществляющегося уже ферментом ДНК-полимеразой (см. рис.). Цепь и-РНК гидролизуется РНК-азой, а шпилька (одноцепочечная ДНК) – эндонуклеазой S1. В результате получится двухцепочечная молекула к-ДНК, соответствуюшая структурному гену, с которого транскрибировалась исходная молекула и-РНК. К полученной ДНК присоединяют «липкие» концы для встраивания в плазмиду и размножения гена. Подобная схема была использована для получения генов, кодирующих инсулин, гормона роста, интерферона, альбумина, иммуноглобулинов и др. белков, производство которых уже налажено в промышленных масштабах. Возможно и соединение фрагментов ДНК с «тупыми» концами за счет действия ДНК-лигазы, но эффективность такого «сшивания» на порядок ниже.
Схема синтеза двуцепочечной к-ДНК на м-РНК (и-РНК)
Разработаны методы соединения фрагментов ДНК с «липкими» и «тупыми» концами, что позволяет создавать рекомбинантные молекулы ДНК и в тех случаях, если даже эти фрагменты были получены с использованием различных рестриктаз. Под рекомбинантными ДНК понимают ДНК, образованные объединением in vitro двух и более фрагментов ДНК, выделенных из различных биологических источников.
Химико-ферментативный синтез
Химико-ферментативный синтез генов применяется наиболее часто. Химическим путем синтезируют олигонуклеотиды: линкеры, адаптеры, праймеры, промоторы, а гены синтезируют ферментативным методом. Линкеры (англ. «Iink» – соединять) – короткий двухцепочечный олигонуклеотид, содержащий сайты узнавания для ряда рестриктаз. Адаптеры – это линкеры, содержащие более одного сайта узнавания рестриктазой, он предназначен для соединения фрагментов с несовместимыми концами. Праймеры – короткие одноцепочечные фрагменты, комплементарные началу или концу гена. Промотор (80-10 нуклеотидов) – фрагмент ДНК, узнаваемый РНК-полимеразой.
Заключение
В медицине биотехнологические приемы и методы играют ведущую роль при создании новых биологически активных веществ и лекарственных препаратов, предназначенных для ранней диагностики и лечения различных заболеваний. Антибиотики — самый большой класс фармацевтических соединений, получение которых осуществляется с помощью микробиологического синтеза. Созданы генноинженерные штаммы кишечной палочки, дрожжей, культивируемых клеток млекопитающих и насекомых, используемые для получения ростового гормона, инсулина и интерферона человека, различных ферментов и противовирусных вакцин. Изменяя нуклеотидную последовательность в генах, кодирующих соответствующие белки, оптимизируют структуру ферментов, гормонов и антигенов (так наз. белковая инженерия). Важнейшим открытием явилась разработанная в 1975 Г. Келером и С. Мильштейном техника использования гибридом для получения моноклональных антител желаемой специфичности. Моноклональные антитела используют как уникальные реагенты, для диагностики и лечения различных заболеваний.
Дальнейший прогресс человечества во многом связан с развитием биотехнологии. Вместе с тем необходимо учитывать, что неконтролируемое распространение генноинженерных живых организмов и продуктов может нарушить биологический баланс в природе и представлять угрозу здоровью человека.
Нужна помощь в написании реферата?
Мы - биржа профессиональных авторов (преподавателей и доцентов вузов). Наша система гарантирует сдачу работы к сроку без плагиата. Правки вносим бесплатно.
Список использованных источников
1. «Генетика человека». Фогель Ф., Мотульски А. в 3-х томах, 1989-1990 гг.
2. «Микробиология». Воробьев А.В., Быков А.С., Пашков Е.П., Рыбакова А.М. Учебник. – 2-е изд., перераб. и доп. – М.: Медицина, 2003. – 336 с.
3. «Биотехнология». Под ред. Егорова Н.С., Самуилова В.Д.. Учеб. Пособие для вузов. В. 8 кн./ Кн. 2. Современные методы создания промышленных штаммов микроорганизмов/ Дебабов В.Г., Лившиц В.А. – М.: Высш. Шк., 2000. – 208 с.: ил.
4. «Генетика человека: былое и грядущее». Гнатик Е.Н. / М.: Издательство ЛКИ, 2007
5. «Генетическая инженерия». Щелкунов С.Н. / Сибирское университетское издательство, Новосибирск, 2004
6. www.wikipedia.org