Установлены константы скорости реакции k7 с пероксильными радикалами для наиболее активных АО.
ABSTRACT
Developed kinetic model lipid rapid testing antioxidant activity (AOA) of various classes of organic compounds. The rate of oxidation of lipids in model water-emulsion medium is 1000 times higher than in non-aqueous medium. Investigated AOA important organic inhibitors compared with standard antioxidants dibunol and α-tocopherol the water-catalyzed lipid substrates. Set the rate constant of k7 with peroxyl radicals for the most active AO. The participation of effective inhibitors of oxidation in the process of destruction by molecular hydroperoxides.
Ключевые слова: каталитическое окисление липидов, экспресс-тестирование антиоксидантной активности, пероксидное окисление, соли металлов переменной валентности, мицеллы, водно-эмульсионная среда.
Keywords: catalytic oxidation of lipids, rapid testing antioxidant activity, lipid oxidation, salts of metals of variable valency, micelles, water-emulsion environment.
В связи с широким внедрением ингибиторов окисления, актуальной остается проблема предварительного тестирования их антиоксидантной активности. Поскольку большинство известных моделей для тестирования антиоксидантов являются гидрофобными, представлялось актуальным подобрать гидрофильную липидную систему и проверить её эффективность на примере известных химических соединений, предположительно имеющих антиоксидантную активность, сравнить их действие с реперными ингибиторами окисления.
Известно, что катионы металлов входят в структуру биокластеров, активных центров многочисленных белков-ферментов. Так, железо входит в состав гемоглобина, цитохромов, каталазы, содержится в ферритине, трансферрине. Кобальт входит в состав цианокобаламина (витамина В12), его аналоги являются кофакторами различных ферментов, участвующих в эритропоэзе. Медь содержится в цитохроме-С-оксидазе, в голубых белках, супероксиддисмутазе [2].
Особенности окисления липидов в клетке обусловлены, прежде всего, каталитической активностью катионов металлов и возможностью участия ферментов в регулировании этих процессов. Известны многочисленные работы по тестированию активности катионов металлов, которые относятся, в основном, к катализу гомогенных липидных систем [1, 13—19]. Эти результаты имеют ограниченное значение для описания процессов окисления, протекающих в мицеллах и живой клетке. Мало работ, в которых сравниваются антиоксидантные свойства соединений различных классов в безводной и водно-эмульсионной (ВЭС) средах в условиях инициирования и катализа.
Целью данного исследования являлась разработка кинетического способа тестирования антиоксидантной активности различных классов органических соединений (фенолов, аминов, серосодержащих соединений), в условиях, приближенных к биологическим средам, изучение антиоксидантной активности ряда полифункциональных соединений в сравнении с реперными антиоксидантами дибунолом и a-токоферолом.
Экспериментальная часть
Антиоксидантную активность (АОА) изучали манометрическим методом поглощения кислорода в модифицированной установке типа Варбурга при окислении модельного субстрата (метиллинолеата (МЛ), метилолеата (МО) и этилолеата (ЭО)) в присутствии триметилцетиламмоний бромида (ЦТМАБ) в качестве поверхностно-активного вещества (ПАВ) (10-4—10-2 М), с добавками растворов солей металлов в количестве (10-6—10-1 М) при t=(60±0,2)0С. Соотношение воды и эфира составляло 3:1, а общий объем пробы 4 мл [10]. Кинетику поглощения кислорода в безводной среде изучали в среде инертного растворителя хлорбензола, процесс инициировали за счет термического разложения АИБН. Использовали термостатируемую окислительную ячейку объёмом 2—5 см3, окисление проводили кислородом воздуха, температура опытов составляла (60±0,2)0С. Графическим методом определяли величину периода индукции (ti), представляющей собой отрезок оси абсцисс, отсекаемый перпендикуляром, опущенным из точки пересечения касательных, проведенных к кинетической кривой. Эффективность торможения процесса окисления липидного субстрата определяется совокупностью реакций ингибитора и обозначает его антиоксидантную активность, количественно определяемой по формуле АОА= ti–tS /tS, где tS и ti — периоды индукции окисления субстрата в отсутствие и в присутствии исследуемого АО соответственно, сравнивали с действием ингибитора, принятого за стандарт, используя отношение ti / tреп,, где tреп. — период индукции реперного ингибитора. Скорость инициирования определяли уравнением Wi = f [InH] / ti, где f — стехиометрический коэффициент ингибирования, [InH] — концентрация ингибитора, ti — период индукции.
Антирадикальную активность (АРА) тестировали в системе инициированного окисления этилбензола хемилюминесцентным (ХЛ) методом совместно с к.х.н. И.Ф. Русиной [9]. Кинетику накопления гидропероксидов изучали при аутоокислении модельных субстратов (МО и линолевой кислоты (ЛК)) методом обратного йодометрического титрования в среде хлорбензола, t=60°С [6]. В качестве реперных ингибиторов использовали a-токоферол (a-ТФ) и дибунол, при этом концентрации АО были сравнимыми. Критическую концентрацию мицеллообразования ЦТМАБ изучали методом Ребиндера и рефрактометрическим методом.
Результаты и их обсуждение
Разработка кинетического метода базировалась на исследовании активности солей металлов переменной валентности: сульфата железа (II), хлорида железа (III), хлорида никеля (II), хлорида кобальта (II), хлорида меди (II) в водно-липидных субстратах. Для эмульгирования модельного субстрата использовали поверхностно-активное соединение ЦТМАБ, в качестве липидов исследованы: метилолеат, этилолеат, метиллинолеат, линолевая кислота. С целью выбора наиболее эффективного катализатора изучали в сравнительном аспекте влияние упомянутых выше солей на процесс окисления МЛ. Более детальное изучение кинетики окисления липидных субстратов в присутствии металлов переменной валентности было показано раннее в работе [10].
На рисунке 1 представлены кинетические кривые (КК) поглощения кислорода в присутствии равных добавок (1´10-3 М) солей железа (II,III), никеля (II), кобальта (II) и меди (II). Из рис. 1 видно, что в сравнимых концентрациях наиболее эффективным катализатором является хлорид меди (II). Для него отмечается наибольшая скорость процесса, оцениваемая из наклона кинетических кривых (КК). При сопоставлении абсолютных значений максимальной скорости окисления (Wмах) исследуемые катализаторы располагаются в следующем порядке: NiCl2 < FeCl3 < Fe2SO4 < CoCl2 < CuCl2.
Нужна помощь в написании статьи?
Мы - биржа профессиональных авторов (преподавателей и доцентов вузов). Пишем статьи РИНЦ, ВАК, Scopus. Помогаем в публикации. Правки вносим бесплатно.
Рисунок 1. Кинетика окисления МЛ в водно-эмульсионной среде в присутствии добавок солей металлов в концентрации 1×10-3 М : 1 — CuCl2, 2 — FeSO4, 3 — CoCl2, 4 — FeCl3, 5 — NiCl2, 1×10-3 М СЦТМАБ, t=60° С
В результате исследований установлено, что аутоускоренный характер имеет кинетика окисления водно-липидных субстратов только в присутствии катионов Fe2+, Co2+ и Cu2+. Характер кинетических кривых окисления липидных субстратов в зависимости от концентрации катионов позволил предполагать преобладающее участие Fe3+ , Ni2+ в обрыве цепей, участие Fe2+, Co2+, Cu2+ в зарождении и разветвлении цепей.
Рисунок 2. Зависимость стационарных скоростей окисления МЛ в присутствии солей катализаторов от их концентрации, М:1 — NiCl2, 2 — FeCl3, 3 — Fe2SO4, 4 — CoCl2, 5 — CuCl2, 1×10-3 М СЦТМАБ, t=60° С
Действие упомянутых выше солей было изучено в широком диапазоне концентраций для отбора среди них наиболее эффективных катализаторов. На рисунке 2 приведены закономерности изменения максимальной скорости процесса окисления от концентрации катализатора. Можно видеть, что концентрационные зависимости для всех веществ носят экстремальный характер, экстремумы проявляются в разных диапазонах.
Скорости окисления липидных субстратов в присутствии солей NiCl2 и FeCl3 выходят на максимум при концентрациях 1,0×10-3 М, далее с ростом концентрации их значение не меняется и составляет (4,0±0,2)×10-5 М×с-1 и (5,0±0,3)×10-5М×с-1 соответственно. Максимальная скорость при окислении с добавками сульфата железа отмечается в диапазоне (0,1—1,0) М и составляет (9,4±0,4)×10-5 М×с-1, при дальнейшем росте концентрации — остается постоянной и составляет (6,0±0,2)×10-5 М×с-1. Зависимость Wmax систем с добавками хлорида кобальта имеет ″пик″ при концентрации (9—11)×10-3 М, при которой ее величина составляет (24,4±0,4)×10-5 М×с-1. Хлорид меди по своим каталитическим свойствам выделяется среди всех исследуемых веществ. Скорость окисления в присутствии хлорида меди выше в 5 раз, чем в присутствии других солей металлов переменной валентности и при концентрации 2×10-3 М составляет (26,3±0,3)×10-5 М×с-1 (табл.1).
Таблица 1.
Кинетические параметры окисления метиллинолеата в присутствии солей железа (II,III), никеля (II), кобальта (II) и меди (II) в ВЭС, t= 600С, С ЦТМАБ = 1´10-3 М, вода:липиды — 3:1.
В нашем эксперименте каталитическая активность солей металлов уменьшается в ряду: Cu2+ > Fe2+ > Fe 3+ > Co2+> Ni2+. Ранее каталитическое действие металлов переменной валентности изучалось при окислении растительных масел и модельных липидных субстратов [13, 14, 2, 16, 17—19]. Был получен ряд каталитической активности катионов : Cu2+ > Mn2+ > Fe2+ > Cr2+ > Ni2+ >> Zn2+. Как видно из приведенных выше данных изученные соли вписываются в указанный ряд активности металлов, а хлорид меди обладает наибольшей каталитической активностью при наименьшей концентрации 2´10-3 М.
Следующим этапом создания модели для тестирования антиоксидантов был выбор концентрации ЦТМАБ. Известно [4, 5], что скорость окисления в гомогенных системах ниже, чем в эмульсиях и зависит от степени ее дисперсности. В работе [2] установлено, что соотношение констант скорости роста и обрыва цепи при инициированном окисление кумола в эмульсиях и гомогенной системе соотносится как 5,5:1 и равно 110 и 20 соответственно.
Нужна помощь в написании статьи?
Мы - биржа профессиональных авторов (преподавателей и доцентов вузов). Пишем статьи РИНЦ, ВАК, Scopus. Помогаем в публикации. Правки вносим бесплатно.
Нами также было установлено, что скорость окисления МЛ в водно-эмульсионной среде ~ в 1000 раз выше, чем в безводной среде.
При выборе оптимальной концентрации ЦТМАБ исследовали диапазон (10-4—10-2) М. Установлено, что с ростом концентраций ПАВ скорость процесса проходит через максимум, соответствующий концентрации 1 × 10-3 М. Дальнейшее повышение концентрации ЦТМАБ приводит к снижению скорости окисления. Указанную концентрацию детергента, обеспечивающую наибольшую скорость реакции, можно рекомендовать для использования в гетерогенных моделях окисления. Методом Ребиндера и рефрактометрическим методом была определена критическая концентрация мицеллообразования ЦТМАБ (1,0±0,2) × 10-3 М, что соответствовало кинетическим данным.
Механизм каталитического окисления липидов в водно-эмульсионной среде сводится к следующему: в присутствии ЦТМАБ формируются мицеллы. Добавки катионного ПАВ усиливают мицеллообразование, при этом катионы внедряются в промежутки между углеводородными «хвостами» и образуют двойной электрический слой. При образовании свободных радикалов высших жирных кислот катионы катализатора должны иметь доступ к гидрофобным хвостам субстрата. При низких концентрациях катионы катализатора имеют большую вероятность донорно-акцепторного взаимодействия с эфирными группами субстрата, приводящего к образованию в присутствии катализатора свободных радикалов по реакции:
Вероятно, существуют оптимальные концентрации ЦТМАБ, при которых количество контактов катиона катализатора, липидов и кислорода максимально. При увеличении концентрации ЦТМАБ количество катионов на поверхности мицеллы возрастает, происходит более интенсивное отталкивание катионов катализатора, снижение скорости зарождения цепей и скорости процесса окисления.
В соответствии с приведенной гипотезой, добавки 1×10-3 М ЦТМАБ являются оптимальными, обеспечивающими максимальный контакт катионов меди и кислорода с жирно-кислотными радикалами. Увеличение концентрации ПАВ снижает количество таких контактов, и скорость процесса соответственно.
Механизм действия металлов связывают с каталитическим разрушением гидропероксидов в соответствии с реакциями [4]:
Образующиеся при этом алкоксильные и пероксильные радикалы участвуют в дальнейшем в реакциях продолжения цепей окисления. Катионы металлов могут конкурентно участвовать в обрыве цепей, что должно приводить к замедлению процесса на глубоких стадиях окисления. Замедление процесса возможно также за счет перехода катиона металла в менее активную форму.
Таким образом, результаты настоящего исследования демонстрируют возможности новой кинетической модели, которая может быть предложена для изучения процессов свободно-радикального окисления липидных субстратов различного происхождения.
Подобные закономерности наблюдаются и при окислении этилолеата и метилолеата.
На основе проведенных исследований была предложена новая кинетическая модель для тестирования биоантиоксидантов. Модельный субстрат содержит 2×10-3 М хлорида меди (II), 1×10-3 М ЦТМАБ, липиды (МО, ЭО, МЛ) и воду, соотношение липиды-вода 1 : 3.
Нужна помощь в написании статьи?
Мы - биржа профессиональных авторов (преподавателей и доцентов вузов). Пишем статьи РИНЦ, ВАК, Scopus. Помогаем в публикации. Правки вносим бесплатно.
В настоящем работе приведены результаты исследования кинетики каталитического окисления липидного субстрата в водно-эмульсионной среде в присутствии ряда полифункциональных соединения в зависимости от концентрации и структуры, без учета спектра их фармакологического действия. Ряд производных фенола составили: салициловая кислота, парацетамол, осалмид. Ряд двухатомных фенолов представляли: пирокатехин, адреналин, метилдофа. В качестве гетероциклических производных использовались: фентоламин, аллопуринол, эмоксипин. В качестве аминов исследовали: новокаин, коринфар. В качестве серосодержащего соединения изучали капотен. Реперными АО послужили a-токоферол и дибунол. Химические формулы изучаемых соединений представлены в табл. 2.
Для доказательства свободно-радикального механизма каталитического окисления липидного субстрата использован метод ингибиторов. Проведено исследование закономерностей окисления модельного субстрата (МЛ, ЭО) в присутствии добавок стационарных ингибиторов окисления дибунола и a-токоферола. По результатам эксперимента рассчитаны кинетические параметры окисления субстратов.
В нашем исследовании показан идентичный характер КК окисления ЭО в растворе хлорбензола в присутствии 6×10-3 М инициатора и водно-эмульсионной системе в присутствии 2×10-3 М хлорида меди при разных концентрациях дибунола (Рис. 3 а. б). Показано, что в водно-эмульсионной среде дибунол проявляет себя как сильный ингибитор: наблюдается период полного торможения, период аутоускорения и достижение максимальной скорости окисления. Периоды индукции увеличиваются пропорционально увеличению концентрации дибунола. Наличие торможения в присутствии добавок дибунола является признаком радикально-цепного механизма процесса. По наклону прямой в координатах t,[InH] была рассчитана скорость инициирования в обеих системах (Рис.4), получены значения 6,2×10-8 и 6,7×10-5 М×с-1 в безводной и водно-эмульсионной системе соответственно. Сравнение максимальных скоростей окисления ЭО при t=(60 ± 0,2)°С в безводной и водно-эмульсионной средах равных 1,3×10-7 и 1,4×10-4 М×с-1 соответствует различию скоростей инициирования ~ в 1000 раз.
Рисунок 3 а. Кинетика окисления этилолеата в безводной среде в присутствии добавок дибунола, М : 1 — контроль, 6×10-3 М АИБН; 2 — 5×10-6, 3 — 1×10-5, 4 — 5×10-5, 5 — 1×10-4, 6 — 5×10-4, 7 — 7,5×10-4, 8 — 1×10-3, t=60° С
Было показано, что реперный биоантиоксидант a-токоферол в ВЭС проявлял слабые антиоксидантные свойства, в концентрациях свыше 1×10-3 М промотировал процесс окисление липидных субстратов (рис. 5, табл. 4). Полученные результаты указывают на более сложный механизм действия a-токоферола в катализируемом субстрате. Причиной ускорения процесса может быть комплексообразование OH-группы a-токоферола с катализатором. В процессе окисления a-токоферол образует достаточно активные токофероксильные радикалы, способные участвовать в побочных реакциях продолжения цепей с молекулами субстрата (RH):
Рисунок 3 б. Кинетика окисления этилолеата в водно-эмульсионной среде в присутствии добавок дибунола, моль/дм3 : 1 — контроль, 2×10-3 моль/дм3 CuCl2; 2 — 1×10-6, 3 — 2×10-5, 4 — 5×10-5, 5 — 1×10-4, 6 — 5×10-4, t=60° С
Поскольку известно [3, 8, 11, 12], что в углеводородной среде увеличение АРА фенолов происходит под влиянием электронодонорных заместителей, рассмотрим полученные ряды соединений в зависимости от структуры.
В соответствии с теорией, ингибиторы условно делятся на сильные и слабые. Сильные ингибиторы эффективно тормозят окисление, участвуя только в реакциях обрыва цепей. Кинетика такого процесса характеризуется периодом полного торможения, аутоускорением и достижением максимальной скорости. Слабые ингибиторы способны не только обрывать цепи, но из-за высокой активности своих радикалов, участвовать в реакциях продолжение цепей. Кинетика такого процесса характеризуется отсутствием периодом полного торможения, достаточно высокими начальными скоростями, аутоускорением на определенном уровне окисления, достижением максимальной скорости. Алкилированные в пара- и орто-положения фенолы, двухатомные фенолы считаются сильными нигибиторами. Каждая алкильная или гидроксильная группа увеличивает АРА на определенную величину. Ингибитор тем эффективнее, чем меньше полярность и больше размер заместителя в пара- положении. В аминах заместители электронодоноры повышают их антирадикальную активность. В фенолах и аминах антирадикальная активность тем выше, чем ниже окислительно-восстановительный потенциал. Иногда амины оказывают ускоряющее действие, сто связано с увеличением скорости зарождения цепей за счет взаимодействия с гидропероксидами по радикальному механизму.
Нужна помощь в написании статьи?
Мы - биржа профессиональных авторов (преподавателей и доцентов вузов). Пишем статьи РИНЦ, ВАК, Scopus. Помогаем в публикации. Правки вносим бесплатно.
Рисунок 4. Зависимости периода индукции от концентрации дибунола в безводной среде в присутствии 6×10-3 моль/дм3 АИБН ( 1 ) и в водно-эмульсионной среде в присутствии 2×10-3 моль/дм3 CuCl2 ( 2 ), t=60° С
Методом хемилюминесценции в группе исследуемых соединений была оценена величина константы скорости реакции k7 АО с пероксильными радикалами [9]:
где: InH — ингибитор окисления,
In• — радикал ингибитора,
RO2•— пероксильный радикал.
Таблица 2.
Химические формулы изучаемых антиоксидантов