Реконструктивная и восстановительная хирургия желчных путей является одной из практических областей медицины, где восстановление и длительное сохранение физиологических функций имплантатов может быть достигнуто посредством использования достижений современной тканевой инженерии.
Ежегодно в мире более 15 тыс. пациентов нуждаются в восстановлении нормального желчеоттока вследствие интраоперационных травм (Lau et al., 2010; Stewart, 2014). С целью решения данной проблемы на сегодняшний день разработаны и широко применяются многочисленные методики реконструктивных операций по восстановлению дренажной функции желчного протока, основанные на проведении пластики аутологичными тканями (Марков, 2015; Cheng et al., 2012) и применении билиарных стентов (Дюжева и соавт., 2012; Giménez et al., 2016). Однако отмечается, что такие типы реконструктивных и восстановительных операций на желчных протоках сопровождаются развитием ранних и поздних послеоперационных осложнений, нивелирующих их положительный эффект (Гальперин и соавт., 2009; Carroll, 2017; Moore et al., 2017; Rystedt et al., 2016), что позволяет констатировать отсутствие адекватного решения проблемы восстановления дренажной функции желчного протока.
Одним из перспективных направлений восстановления дренажной функции желчного протока является реконструкция поврежденных желчных протоков с применением методов тканевой инженерии. В рамках применения известных методов тканевой инженерии реконструкция желчного протока может осуществляться посредством использования соответствующих типов клеток, полученных in vitro и размещенных на матриксах природного либо синтетического происхождения (De Assuncao et al., 2017; Justin et al., 2018).
Между тем, исходя из клинического опыта, применение биоинженерных тканей, созданных с использованием клеток и синтетического каркаса, приводит к развитию послеоперационных осложнений, таких как ишемическое повреждение клеток, очаговые и системные инфекции, формирование фиброза (Giwa et al., 2017), которые сводят на нет успешно проведенную операцию.
Для снижения опасности развития послеоперационных осложнений должна быть использована технология изготовления каркаса, способного обеспечить надлежащую функцию. Для этого каркас должен быть не только биосовместимым и биодеградируемым, но и васкуляризированным, а также пригодным к длительному выполнению физиологических функций, не препятствуя свободному желчетоку. Данным требованиям соответствует тканеинженерная витализированная конструкция желчного протока, однако такой конструкции до сих пор создано не было.
Степень разработанности темы исследования. Витализация и обеспечение длительного функционирования тканеинженерных конструкций желчного протока является одной из актуальных задач, стоящих перед современной абдоминальной хирургией и гепатологией. Известны работы по созданию и витализации каркасов желчного протока из синтетических материалов путем заселения их клетками (Zong et al., 2017), модификации каркасов биологически активным соединением (Li et al., 2012), однако комбинации витализирующих агентов не применялись, и кроме того, использованные ранее подходы не позволяли спроектировать физиологически совместимый имплантат для обеспечения его длительного функционирования.
Цель исследования – создать многослойную тканеинженерную конструкцию желчного протока, состоящую из клеток, адгезированных на биосовместимом и биодеградируемом каркасе, длительная дренажная функция которого обеспечивается его предварительной витализацией.
Задачи исследования:
1. Создать несколько типов биодеградируемых и биосовместимых волокнистых материалов и изучить их свойства, а также отобрать наиболее перспективные материалы, способные обеспечить восстановление и длительное сохранение дренажной функции желчного протока за счет применения методов их модификации.
2. Разработать дизайн тканеинженерной конструкции желчного протока на основе изготовленного методом электроформования трубчатого многослойного каркаса, обеспечивающего восстановление желчеоттока и длительный дренаж желчи.
3. Оценить физико-механические и биологические свойства изготовленных биосовместимых и биодеградируемых волокнистых каркасов тканеинженерной конструкции.
4. Изучить сохранность дренажной функции имплантированного биосовместимого и биодеградируемого трубчатого каркаса тканеинженерной конструкции желчного протока на модели повреждения общего желчного протока у крупного лабораторного животного (свинья).
5. Разработать методику модификации каркаса с использованием эпидермального фактора роста и плазмиды с геном фактора роста эндотелия сосудов (препарат «Неоваскулген»), а также оценить биологический и физиологический эффект использования таких каркасов в экспериментах in vitro и in vivo.
6. Создать тканеинженерную конструкцию желчного протока, витализированную биологически активными соединениями и клеточными культурами.
Научная новизна. Проведена оценка физико-механических и биологических свойств биодеградируемых и биосовместимых волокнистых материалов (поликапролактон, поли(L,D-лактид-со-гликолид), поли(L-лактид-со-ε- капролактон) и диацтат целлюлозы). Было установлено, что наиболее пригодными материалами для изготовления каркасов по своим биологическим и физико- механическим свойствам являются поликапролактон и поли(L,D-лактид-со- гликолид).
На основе трубчатого многослойного каркаса из отобранных биодеградируемых и биосовместимых волокнистых материалов разработана усовершенствованная тканеинженерная конструкция желчного протока, созданная из материалов с инкорпорированными биологически активными соединениями и двухслойным клеточным покрытием, причем внутренний слой заселен эпителиальными клетками желчного протока, а наружный – мультипотентными мезенхимальными стромальными клетками костного мозга.
Методом эмульсионного электроформования создан многослойный каркас с механическими свойствами, соответствующими свойствам нативного матрикса желчного протока.
Для длительного обеспечения дренажной функции желчного протока впервые использован способ витализации каркаса тканеинженерной конструкции модификацией биосовместимого и биодеградируемого волокнистого поликапролактона с включением в структуру волокон эмульсии с плазмидой, содержащей ген фактора роста эндотелия сосудов (VEGF165), и эмульсии с эпидермальным фактором роста (EGF). Методом биосенсорного анализа в режиме реального времени на клеточном анализаторе iCELLigence доказана эффективность модификации волокнистого поликапролактона с использованием EGF с целью стимулирования пролиферации клеток. При имплантации волокнистого поликапролактона, модифицированного препаратом «Неоваскулген», отмечена стимуляция васкулогенеза по мере биорезорбции материала. Применение трубчатого каркаса из поликапролактона на крупном лабораторном животном (свинья) при моделировании интраоперационной травмы желчного протока не показало обтурации просвета солями желчных кислот и выраженного воспаления тканей.
Получены патенты на изобретения «Способ изготовления трехслойного каркаса для протезирования желчного протока» (RU 2630061) и «Способ получения тканеинженерной конструкции» (RU 2661738), а также на полезную модель «Каркас для протезирования желчного протока» (RU 163630).
Теоретическая и практическая значимость работы. Впервые разработан и обоснован дизайн тканеинженерной конструкции желчного протока, который предназначен для предотвращения возникновения не только ранних, но и поздних послеоперационных осложнений при восстановительных операциях на желчных путях. Предложенные в работе подходы к выбору и созданию материалов с биологически активными свойствами для получения многослойного каркаса тканеинженерной конструкции могут быть использованы при разработке имплантируемых медицинских изделий.
Метод эмульсионного электроформования может быть использован для изготовления многослойных каркасов с физико-механическими свойствами, соответствующими свойствам нативных тканей. Разработана методика витализации каркаса тканеинженерной конструкции препаратом «Неоваскулген» и эпидермальным фактором роста, обеспечивающая пролонгированный и контролируемый выход веществ по мере резорбции каркаса для поддержания функционализации трансплантата. Разработанные методы получения витализированных материалов и композитных каркасов могут быть использованы для создания тканеинженерных конструкций полых эпителиальных органов.
Настоящая работа выполнена в рамках проекта «Создание тканеинженерной конструкции на основе биоразлагаемых и биосовместимых материалов с заданными свойствами для воспроизведения многослойных естественных живых структур», реализуемого в Первом МГМУ им. И.М.Сеченова Минздрава России по соглашению о субсидии №14.604.21.0133 с Минобрнауки России (шифр RFMEFI60414X0133); руководитель проекта – д.м.н., профессор Дюжева Т.Г.; Индустриальный партнер – ПАО «Институт стволовых клеток человека» (А.А. Исаев, к.м.н. Р.В. Деев, к.м.н. И.Я. Бозо).
Методология и методы исследования. Методом электроспиннинга изготовлены каркасы из волокнистых полимерных материалов, в том числе образцы, содержащие GFP, EGF и генотерапевтический препарат «Неоваскулген». Проведены физико-механические испытания и сканирующая электронная микроскопия поверхности. Для оценки высвобождения биологически активных молекул, биологической активности и влияния на окружающие ткани проведены культуральные работы in vitro, а также имплантация образцов в эксперименте in vivo. Проведены морфологические исследования эксплантированных образцов методами гистологии и иммуногистохимии. Работа с лабораторными животными выполнялась в Центральном виварии Первого МГМУ им. И.М. Сеченова Минздрава России.
Основные положения, выносимые на защиту
1. Систематизация требований для обеспечения биологической и физиологической совместимости тканеинженерной конструкции желчного протока позволяет обосновать методы и подходы к изготовлению многослойного трубчатого каркаса тканеинженерной конструкции из поликапролактона и поли(L,D-лактид-со-гликолида).
Нужна помощь в написании автореферата?
Мы - биржа профессиональных авторов (преподавателей и доцентов вузов). Наша система гарантирует сдачу работы к сроку без плагиата. Правки вносим бесплатно.
2. Метод эмульсионного электроформования пригоден для создания многослойного каркаса тканеинженерной конструкции с механическими свойствами, соответствующими свойствам нативного желчного протока.
3. Созданные методом электроформования трубчатые многослойные композитные каркасы из полимеров с различной кинетикой резорбции по своим механическим свойствам соответствуют нативному желчному протоку и обеспечивают возможность многослойного заселения каркаса тканеинженерной конструкции ex vivo путем сначала тканевого культивирования эпителиальных клеток желчного протока, а затем динамического культивирования мультипотентных мезенхимальных стромальных клеток костного мозга с жизнеспособностью в конструкции более 85%.
4. Модификация материала каркаса тканеинженерной конструкции фактором роста EGF способствует пролонгированному выходу молекул белка EGF in vitro по мере резорбции материала и стимулированию пролиферации клеточной культуры эпителиального происхождения.
5. Витализация материала каркаса тканеинженерной конструкции плазмидой с геном фактора роста эндотелия сосудов (генотерапевтический препарат «Неоваскулген») способствует пролонгированному росту сосудов в зоне имплантации in vivo.
Апробация результатов исследования. Апробация диссертации состоялась
12 апреля 2018 г. на совместном заседании Отдела передовых клеточных технологий Института регенеративной медицины и Кафедры госпитальной хирургии лечебного факультета ФГАОУ ВО Первый МГМУ им. И.М. Сеченова Минздрава России. Материалы и основные положения работы доложены и обсуждены на всероссийских и международных конференциях по специальности
«Патологическая физиология», в том числе Международной научной конференции «Трансляционная биомедицина: современные методы междисциплинарных исследований в аспекте внедрения в практическую медицину» (г. Санкт-Петербург, 10–12 ноября 2015 г.), конференции «Современные подходы к лечению механической желтухи» (г. Москва, 19 ноября 2015 г.), II Национальном конгрессе по регенеративной медицине (г. Москва, 3–5 декабря 2015 г.), XI Международной (XX Всероссийской) Пироговской научной медицинской конференции студентов и молодых ученых (г. Москва, 17 марта 2016 г.), I-м Национальном хирургическом конгрессе (г. Москва, 4–7 апреля 2017 г.), XXIII конгрессе Ассоциации гепатопанкреатобилиарных хирургов стран СНГ (г. Минск, 14-16 сентября 2016 г.), IX научных чтениях, посвященных 100-летию со дня рождения академика РАМН Е.Н. Мешалкина (г. Новосибирск, 16–18 июня 2016 г.), Международном симпозиуме “Нанотехнологии в хирургии: сегодняшний день и перспективы развития” (г. Москва, 16 мая 2017 г.), Международной конференции Sechenov International Biomedical Summit 2017 (г. Москва, 16–20 июня 2017 г.), Международной конференции «Клиническая протеомика. Постгеномная медицина 2017» (г. Москва, 30 октября – 1 ноября 2017 г.), III Национальном конгрессе по регенеративной медицине (г. Москва, 15–18 ноября 2017 г.), Международной конференции и выставке TERMIS-AM 2017 (г. Шарлотт, США, 3–6 декабря 2017 г.).
Достоверность научных положений и выводов. Представленные в работе результаты основаны на данных, полученных с использованием современных методов молекулярной и клеточной биологии, в том числе флуоресцентной микроскопии, иммуноферментного анализа, оценки жизнеспособности клеточных культур, с использованием статистических методов оценки достоверности результатов.
Личный вклад автора. Автором внесен определяющий вклад во все этапы диссертационного исследования, в том числе в проведение анализа литературных данных по теме диссертации, разработку дизайна настоящего исследования, проведение экспериментальных работ, анализ и интерпретацию полученных данных. Часть исследований выполнена совместно с научным коллективом Отдела передовых клеточных технологий Института регенеративной медицины Первого МГМУ им. И.М. Сеченова Минздрава России. Изготовление материалов конструкций и исследование физико-химических и механических свойств материалов проводились совместно с лабораторией полимерных материалов НИЦ «Курчатовский институт» (д.ф.-м.н. С.Н. Чвалун, к.х.н. Т.Х. Тенчурин, к.х.н. А.Д. Шепелев).
Внедрение результатов исследования. Результаты диссертационной работы внедрены в учебный процесс на кафедре госпитальной хирургии лечебного факультета и в практическую деятельность Отдела передовых клеточных технологий Института регенеративной медицины ФГАОУ ВО Первый МГМУ им. И.М. Сеченова Минздрава России.
Соответствие диссертации паспорту научной специальности. Научные положения диссертации соответствуют паспорту специальности 14.03.03 – «Патологическая физиология», конкретно п.8 (“Анализ взаимоотношений общего и частного, части и целого, единства и борьбы противоположностей в динамике развития патологического процесса”) и п.10 (“Разработка новых путей этиологической, патогенетической и саногенетической терапии с учетом взаимодействия терапевтических факторов с защитно-приспособительными механизмами организма”) паспорта специальности «Патологическая физиология». Публикации по теме диссертации. По материалам диссертации опубликовано 14 печатных работ, в том числе 6 работ в изданиях, индексируемых Scopus и рекомендованных ВАК для опубликования материалов диссертаций на
соискание ученой степени.
Структура и объем диссертации. Диссертация состоит из введения, четырех глав, заключения и списка цитируемой литературы. Объем диссертации составляет
205 страниц, включает 67 рисунков, 13 таблиц и список литературы из 395 источников, в том числе 66 на русском языке и 329 на иностранных языках.
Материалы и методы исследования
Материалы для изготовления каркасов тканеинженерной конструкции. Для изготовления одно- и многослойных каркасов методом электроформования использовались ПКЛ, ПДЛГА ((75:25) и (70:30)), ДАЦ, PLCL (70:30) и PLLGA.
Биологически активные соединения, использованные для модификации и визуализации структур волокнистых материалов. Для модификации волокнистых материалов методом эмульсионного электроформования использовались GFP (160 нг на 1 г ПКЛ), EGF (5500 нг на 1 г ПКЛ) и генотерапевтический препарат «Неоваскулген» – 4,1×10-4 г на 1 г ПКЛ (ВКп) и 0,41×10-4 г на 1 г ПКЛ (НКп).
Клеточные культуры. Оценку цитосовместимости и витализацию каркасов проводили с использованием стандартных линий клеток MCF-7 и NIH/3T3, а также полученных из донорского биоматериала ММСК КМ и ЭКЖП. Получение первичных культур клеток человека было одобрено протоколами Локального комитета по этике Первого МГМУ им. И.М. Сеченова Минздрава России.
Лабораторные животные. Экспериментальные работы по имплантации каркасов выполнены на 30-ти самках крыс линии Вистар и одной свинье подвида Sus scrofa domesticus. Животные содержались в Центральном виварии Первого МГМУ им. И.М. Сеченова Минздрава России при свободном доступе к пище и воде и естественной смене светового режима. Все экспериментальные работы выполнены с соблюдением правил биоэтики, утвержденных Европейской конвенцией о защите позвоночных животных, используемых для экспериментов или в иных научных целях (2005 г.), и в соответствии с Правилами лабораторной практики, утвержденными приказом Минздрава России №708 от 23.08.2010 г.
Оценка параметров резорбции образцов каркасов. Оценка резорбируемости материалов проводилась на основе анализа кинетики резорбции и деградации экспериментальных образцов биосовместимого каркаса в различных средах (воде, фосфатном буфере, реактиве Фентона, бессывороточной культуральной среде и культуральной среде с добавлением сыворотки).
Морфологические исследования. Морфологические исследования проводили методами конфокальной микроскопии с окраской образцов гематоксилином- эозином, окраской по Маллори, иммуногистохимическим окрашиванием антителами против CK-Pan, CK19, CD90, а также CD105, CD29, CD3 и CD19.
Изучение биологических эффектов на клетках. Для оценки биологического эффекта использовали МТТ-тестирование, а также биосенсорный анализ в режиме реального времени на клеточном анализаторе iCELLigence (ACEA, США).
Получение экспериментальных образцов волокнистого каркаса. Изготовление экспериментальных образцов каркаса для создания тканеинженерной конструкции желчного протока проводилось методом электроформования, методом эмульсионного электроформования с использованием плюроника F-127, а также методом изготовления композитных каркасов на основе непроницаемых для желчи трубчатых элементов из ПКЛ путем их совмещения с волокнистыми слоями из ПДЛГА, PLLGA, PLDCL или ДАЦ.
Методы статистической обработки. Статистическую обработку данных проводили методом вариационной статистики при помощи компьютерной программы GraphPadPrism 7 (GraphPad Software Inc., США). Различия считали значимыми при p<0,05. Данные представлены как среднее значение±стандартное отклонение или среднее значение±стандартная ошибка среднего.
Результаты и их обсуждение
Проектирование тканеинженерной конструкции желчного протока. Проведен систематический обзор и разработана база данных научных публикаций с результатами клинических и экспериментальных хирургических операций по реконструкции и восстановлению желчных путей. Проведена оценка рисков и этапности послеоперационных осложнений и сформулированы ключевые требования к ТИК.
Выбор синтетических материалов для изготовления каркасов. Волокнистые материалы из волокнистых полимеров были исследованы с помощью клеточных линий NIH/3T3 и MCF-7 при проведении МТТ-теста в трех повторах на каждую точку. Показано статистически значимое увеличение эффективности заселения каркасов культурами клеток NIH/3T3 и MCF-7, соответственно, при динамическом культивирование по сравнению со статичным культивированием. Выбраны волокнистые материалы, наиболее подходящие для заселения фибробластами и эпителиальными клетками при статичном и динамическом методах культивирования. Для фибробластов при статичном методе культивирования – ПКЛ, ДАЦ и PLCL; при динамическом – ПДЛГА и PLCL. Для эпителиальных клеток при статичном методе культивирования – ПКЛ, ДАЦ и PLCL; при динамическом – ПКЛ, ПДЛГА, PLCL.
Исследование свойств волокнистого поликапролактона, модифицированного EGF. Методом эмульсионного электроформования получены образцы волокнистого ПКЛ с инкорпорированными в объем волокна GFP и EGF. Использование плюроника F-127 в качестве ПАВ при электроформовании позволяло улучшить диспергирование содержащих биомолекулы микрокапелек в объеме получаемых волокон. Методом флуоресцентной микроскопии показано включение эмульсии с белком в структуру волокон (Рис. 1а). Методом электронной микроскопии изучена морфология поверхности модифицированного волокнистого ПКЛ.
Методами иммуноферментного и биосенсорного анализа проведена оценка выхода EGF из модифицированных каркасов при резорбции в PBS (Рис. 2а) и определена степень влияния присутствия каркасов на пролиферацию клеточной линии MCF-7.
Показано, что модифицированные волокнистые материалы обладают эффектом стимулирования пролиферации клеточной линии MCF-7.
Изучение активности прорастания сосудов в волокнистый поликапролактон, модифицированный препаратом “Неоваскулген”, при имплантации крысам в хроническом эксперименте. Проведено экспериментальное исследование по подкожной имплантации крысам образцов материала, модифицированного генотерапевтическим препаратом «Неоваскулген». Исследовались образцы тканевых лоскутов с частично биорезорбированным каркасом на сроках 7 сут., а также 16, 33, 46 и 64 сут.
На 16-е сутки отмечено увеличение плотности сосудов в группах с высокой и низкой концентрацией НВГ по сравнению с контролем (на 13% в группе ВКп, p < 0,05), что может объясняться выходом БАС из объема полимерного волокна. На 33-и сутки отмечено уменьшение общей плотности сосудов в контрольной группе, однако, в группе ВКп количество сосудов на 43% (p < 0,001) превысило значения в контроле, что может объясняться выходом препарата НВГ и стимулированием терапевтического роста сосудов. В образцах на 46-е и 64-е сутки после имплантации различий в плотности распределения сосудов в образцах по сравнению с контролем выявлено не было.
Относительное содержание крупных сосудов было схоже в контрольной группе и группах сравнения, при этом на 33-и сутки после имплантации наблюдались максимальные различия в группах высокой и низкой концентрации препарата НВГ (Рис. 4б). Лишь спустя некоторое время происходит образование зрелых сосудов, схлопывание микрососудов и таким образом – общее уменьшение локальной плотности сосудов. Это же мы наблюдали при изучении морфологии препаратов в контроле – в период с 16-х до 64-х суток наблюдалось изменение процентного соотношения сосудов большого калибра диаметром более 15 мкм.
Изучение образцов на всех сроках показало отсутствие в образцах признаков инфильтрации иммунными клетками, в том числе нейтрофилами, признаков воспалительного процесса и отторжения материала, и таким образом отсутствие цитотоксичности материала in vivo. Выявлен дозозависимый эффект на васкуляризацию и ангиогенез при увеличении концентрации препарата “Неоваскулген” в материале. При этом эффект является обратимым, и при прекращении выхода препарата из резорбированного каркаса плотность распределения сосудов приближается к значениям в контроле.
Оценка тканеспецифичной совместимости каркаса из волокнистого поликапролактона на модели повреждения желчного протока свиньи. Выполнено моделирование интраоперационной травмы (неполное пересечение общего желчного протока) свинье подвида Sus scrofa domesticus и проведено стентирование трубчатым волокнистым каркасом из ПКЛ. Спустя 1 месяц после имплантации ПКЛ-каркас с окружающими тканями был изъят и изучен гистологическими методами. Пористая структура каркаса, пропитанного желчью, и низкое количество клеточных элементов в каркасе определялись при фазово- контрастной микроскопии. Эксплантированный каркас сохранил свою целостность и был представлен однородной конструкцией, характеризующейся пористой микроструктурой и пропитанной желчью.
На окрашенных гематоксилином-эозином препаратах отсутствовали признаки выраженного воспаления. Отмечаются участки стенки желчного протока с дистрофией эпителиального слоя и отложениями на них фибрина.
Данный эффект мог быть получен в результате миграции клеток нативного эпителия желчного протока на имплантированный ПКЛ-каркас ввиду его цитосовместимости для ЭКЖП, что подтверждалось флуоресцентной микроскопией.
Нужна помощь в написании автореферата?
Мы - биржа профессиональных авторов (преподавателей и доцентов вузов). Наша система гарантирует сдачу работы к сроку без плагиата. Правки вносим бесплатно.
По результатам изучения материала спустя 1 мес. экспозиции не выявлена воспалительная реакция и наблюдалось отсутствие билиарного сладжа в зоне имплантации.
Исследование механических свойств многослойных волокнистых каркасов при экспозиции в желчи. Получены трехслойные трубчатые каркасы, внутренний и барьерный слой которых получен из ПКЛ, а внешние слои из ПДЛГА или PLCL. Проведено исследование прочностных свойств многослойных трубчатых каркасов при их экспозиции в желчи в течение 14 и 70 суток.
Прочностные свойства каркасов вследствие активной резорбции внешнего слоя на основе ПДЛГА существенно снижаются. Прочность каркасов с внешним слоем на основе PLCL с течением времени уменьшается значительно меньше. По своим прочностным и упругим свойствам композитные каркасы на основе ПКЛ- пленки соответствуют механическим характеристикам тканей желчного протока.
Оценка эффективности витализации многослойного каркаса ТИК клеточными культурами. Создан каркас многослойной витализированной ТИК желчного протока на основе ПКЛ-пленки и волокнистых слоев из ПКЛ и ПДЛГА, модифицированных биологически активными соединениями EGF и НВГ, который по биологической совместимости и физиологической совместимости физико- механических параметров соответствует требованиям к каркасу ТИК желчного протока.
Проведено заселение многослойного композитного каркаса с внешней стороны ММСК КМ с жизнеспособностью клеток 86-94%, а с внутренней стороны ЭКЖП.
Таким образом, получен образец многослойной витализированной ТИК желчного протока, при этом ММСК КМ образовали конфлюэнтный слой в составе такой конструкции.
Заключение
Систематический обзор ретроспективных данных по реконструктивным и восстановительным операциям на желчных путях и их исходах позволил разработать функциональные требования к тканеинженерной конструкции желчного протока, применить многослойный подход к созданию синтетического трансплантата желчного протока и определить необходимые параметры васкуляризации трансплантата.
Режим изготовления модифицированных каркасов из эмульсии с использованием плюроника F-127 позволяет электроформовать каркасы ТИК желчного протока, содержащие БАС белкового и нуклеиновокислотного типа, в том числе зеленый флуоресцентный белок, эпидермальный фактор роста, генотерапевтический препарат “Неоваскулген”, или их смеси в необходимой концентрации. Волокнистые каркасы из ПКЛ при модификации биологически активными соединениями уменьшают свою прочность на 60-70%, а при биорезорбции модифицированных препаратом “Неоваскулген” каркасов обеспечивают увеличение плотности распределения сосудов в месте имплантации.
Многослойные композитные каркасы из ПКЛ и ПДЛГА сохраняют свои механические свойства с прочностными характеристиками, соответствующими нативному желчному протоку. Структура изготовленных волокнистых каркасов позволяет клеткам заселять их на всю глубину. Заселение волокнистого каркаса клетками не приводит к существенному изменению его механических свойств.
Двухслойное заселение многослойного каркаса из модифицированных полимеров клетками ММСК КМ и ЭКЖП позволяет создать ТИК желчного протока для проведения патофизиологического эксперимента по оценке биологической и физиологической совместимости на крупном лабораторном животном.
Выводы
1. Многослойная тканеинженерная конструкция, созданная с учетом основ функционального проектирования, соответствует требованиям, предъявляемым к имплантату желчного протока по следующим биологическим параметрам: отсутствие цитотоксичности для стандартных линий клеток; наличие цитосовместимости полимерных слоев с адгезированными клетками; адекватная геометрия поверхности каркасов, позволяющая формировать монослой первичными культурами клеток; достаточная механическая прочность конструкции; сохранение длительной толерантности к агрессивным компонентам желчи; обеспечение пролонгированных сроков биорезорбции каркаса после имплантации; обеспечение предотвращения билиарного сладжа; обеспечение требуемой прочности, упругости и пластичности; и обеспечение прорастания кровеносных сосудов при имплантации конструкции.
2. Комплексное исследование свойств волокнистых поли(лактид-со- гликолидов), поликапролактона, диацетата целлюлозы, поли(D,L-лактид-со-ε- капролактона) путем тестирования их физико-механических параметров в модельных системах (в реактиве Фентона, фосфатном буфере, воде, желчи, культуральной среде с сывороткой и без нее), а также скрининг их цитосовместимости с использованием клеток мезенхимального (NIH/3T3) и эпителиального (MCF-7) происхождения, позволило создать трубчатый трехслойный каркас с внешним слоем из поли(L,D-лактид-со-гликолида), средним слоем из непроницаемых склеенных волокон поликапролактона и внутренним слоем из волокон поликапролактона. Слои такого трехслойного каркаса обладают различной кинетикой резорбции и деградации в модельных системах, позволяющей сохранять механические свойства на уровне нативного желчного протока и достаточные пластические свойства в течение 2-х месяцев.
3. Модификация каркаса эмульсионным инкорпорированием эпидермального фактора роста в волокнистый поликапролактон приводит к пролонгированному выходу белка из объема полимерного волокна in vitro по мере резорбции материала с максимальным выходом в первые 3 недели (от 200 до 280 пкг/мл), что приводит к стимулированию пролиферации клеток линии MCF-7.
4. Витализация каркаса эмульсионным инкорпорированием генотерапевтического препарата “Неоваскулген” (плазмида VEGF165) в волокна поликапролактона способствует увеличению плотности распределения сосудов на 43% в зоне имплантации каркаса крысам линии Вистар спустя 1 месяц и снижению плотности распределения сосудов до контрольных значений на 2-м месяце.
5. Динамическое культивирование путем вращения каркасов в культуральной среде повышает эффективность витализации каркаса клеточными культурами при создании многослойной тканеинженерной конструкции желчного протока по сравнению со статическим способом заселения клетками, и обеспечивает возможность заселения мультипотентными мезенхимальными стромальными клетками костного мозга с жизнеспособностью в волокнистом материале более 85%.
6. Культивирование волокнистого трубчатого каркаса в контакте с люминальной поверхностью нативного желчного протока создает условия для миграции и адгезии эпителиальных клеток желчного протока на каркас, что позволяет витализировать каркас для получения многослойной тканеинженерной конструкции.
7. Имплантация волокнистого трубчатого каркаса из поликапролактона в общий желчный проток свиньи подвида Sus scrofa domesticus не вызывает отторжения и не приводит ни к обструкции материала солями желчных кислот, ни к образованию билиарного сладжа в течение 1-го месяца.
Нужна помощь в написании автореферата?
Мы - биржа профессиональных авторов (преподавателей и доцентов вузов). Наша система гарантирует сдачу работы к сроку без плагиата. Правки вносим бесплатно.
Практические рекомендации
Разработанные в настоящей работе способы получения биологически и физиологически совместимой ТИК желчного протока могут быть использованы в качестве элементов биоконструктора для разработки и создания тканеинженерных конструкций и моделей полых эпителиальных органов.
Список работ, опубликованных по теме диссертации
Публикации в изданиях, рекомендуемых ВАК
1. Клабуков И.Д., Балясин М.В., Люндуп А.В., Крашенинников М.Е., Титов А.С., Мудряк Д.Л., Шепелев А.Д., Тенчурин Т.Х., Чвалун С.Н., Дюжева Т.Г. Ангиогенная витализация биосовместимого и биодеградируемого матрикса (экспериментальное исследование in vivo). Патологическая физиология и экспериментальная терапия. 2018. Т.62. №2. С. 53-60.
2. Клабуков И.Д., Красильникова О.А., Люндуп А.В., Дюжева Т.Г. Иммунологическая природа желчекаменной болезни (гипотеза). Экспериментальная и клиническая гастроэнтерология. 2018. №06(154). С. 134-142.
3. Клабуков И.Д., Люндуп А.В., Дюжева Т.Г., Тяхт А.В. Билиарная микробиота и заболевания желчных путей. Вестник Российской академии медицинских наук. 2017. Т.72.
№ 3. С. 172-179.
4. Тенчурин Т.Х., Люндуп А.В., Демченко А.Г., Крашенинников М.Е., Балясин М.В., Клабуков И.Д., Шепелев А.Д., Мамагулашвили В.Г., Орехов А.C., Чвалун С.Н., Дюжева Т.Г. Модификация биодеградируемого волокнистого матрикса эпидермальным фактором роста при эмульсионном электроформовании для стимулирования пролиферации эпителиальных клеток. Гены и клетки. 2017. Т.12. №4. С. 47-52.
5. Люндуп А.В., Демченко А.Г., Тенчурин Т.Х., Крашенинников М.Е., Клабуков И.Д., Шепелев А.Д., Мамагулашвили В.Г., Оганесян Р.В., Орехов А.С., Чвалун С.Н., Дюжева Т.Г. Повышение эффективности заселения биодеградируемых матриксов стромальными и эпителиальными клетками при динамическом культивировании. Гены и клетки. 2016. Т.11. № 3. С. 102-107.
6. Дюжева Т.Г., Люндуп А.В., Клабуков И.Д., Чвалун С.Н., Григорьев Т.Е., Шепелев А.Д., Тенчурин Т.Х., Крашенинников М.Е., Оганесян Р.В. Перспективы создания тканеинженерного желчного протока. Гены и клетки. 2016. Т. 11. № 1. С. 43-47.
Патенты на РИД:
7. Шепелев А.Д., Тенчурин Т.Х., Чвалун С.Н., Григорьев Т.Е., Дюжева Т.Г., Люндуп А.В., Мамагулашвили В.Г., Крашенинников М.Е., Крашенинников С.В., Клабуков И.Д. Способ изготовления трехслойного каркаса для протезирования желчного протока. Патент на изобретение RU 2630061 02.11.2016.
8. Дюжева Т.Г., Люндуп А.В., Крашенинников М.Е., Клабуков И.Д. Способ получения тканеинженерной конструкции. Патент на изобретение RU 2661738 29.12.2016.
9. Шепелев А.Д., Тенчурин Т.Х., Чвалун С.Н., Григорьев Т.Е., Дюжева Т.Г., Люндуп А.В., Мамагулашвили В.Г., Крашенинников М.Е., Крашенинников С.В., Оганесян Р.В., Клабуков И.Д. Каркас для протезирования желчного протока. Патент на полезную модель RU 163630 29.12.2015.
Материалы конференций:
10. Dyuzheva T.G., Lyundup A.V., Klabukov I.D., Shepelev A.D., Tenchurin T.K., Krasheninnikov M.E., Mamagulashvili V.G., Krasheninnikov S.V., Balyasin M.V., Demchenko A.G., Lyashenko Y.S., Oganesyan R.V., Titov A.S., Grigoryev T.E., Chvalun S.N. Fabrication Of Tissue-Engineered Constructs For Bile Duct Reconstruction. Tissue Engineering Part A. 2017. Vol. 23. №S1. С. S-44.
11. Тенчурин Т.Х., Шепелев А.Д., Мамагулашвили В.Г., Дюжева Т.Г., Люндуп А.В., Крашенинников М.Е., Клабуков И.Д., Гомзяк В.И., Крашенинников С.В., Бузин А.И.,
Чвалун С.Н. Тканеинженерная конструкция желчного протока на основе биодеградируемых полимеров: механические свойства, деградация in vitro, функционализация факторами роста. Гены и клетки. 2017. Т.12. № 3. С. 242-243.
12. Дюжева Т.Г., Люндуп А.В., Клабуков И.Д., Крашенинников М.Е., Тенчурин Т.Х., Шепелев А.Д., Балясин М.В., Демченко А.Г., Титов А.С., Чвалун С.Н. Тканеинженерная конструкция для восстановления поврежденного желчного протока. Альманах Института хирургии им. А.В.Вишневского. 2017. №1. С. 842-843.
13. Клабуков И.Д., Волчков П.Ю., Люндуп А.В., Дюжева Т.Г. Молекулярная и ферментативная функциональная хирургия будущего. Альманах Института хирургии им. А.В.Вишневского. 2017. №1. С. 1514-1515.
14. Dyuzheva T., Lyundup A., Tenchurin T., Shepelev A., Krasheninnikov M., Demchenko A., Balyasin M., Mamagulashvili V., Klabukov I., Chvalun S. Tissue-engineered matrix of a bile duct based on biodegradable scaffold and cellular component. In: Clinical Proteomics. Postgenome Medicine (ClinProt2017) Book of Abstracts. Moscow: Sechenov University. 2017. С. 105.
15. Клабуков И.Д., Дюжева Т.Г., Люндуп А.В., Тенчурин Т.Х., Шепелев А.Д., Мамагулашвили В.Г., Чвалун С.Н. Влияние физико-химических и механорецепторных свойств полимерных материалов на параметры синтетических матриксов для тканевой инженерии. В сборнике: Программа и научные труды Научной конференции молодых ученых по медицинской биологии ФГБУ ФНКЦ физико-химической медицины ФМБА. М.: ФНКЦ ФХМ ФМБА России, 2016. С. 167-170.
16. Клабуков И.Д., Крашенинников М.Е., Григорьев Т.Е., Шепелев А.Д., Тенчурин Т.Х., Крашенинников С.В., Чвалун С.Н. Изготовление конструкций из биосовместимых материалов для реконструктивной тканевой инженерии желчевыводящих путей. В сборнике: XI Международная (XX Всероссийская) Пироговская научная медицинская конференция студентов и молодых ученых Сборник тезисов. М.: РНИМУ им. Пирогова, 2016. С. 188.
17. Klabukov I. Novel tissue engineering methods for bile duct reconstruction. In: XII Russian-German Conference on Biomedical Engineering Proceedings of the 12th Russian- German Conference on Biomedical Engineering. Vladimir: Vladimir State University, 2016. pp. 29-31.
Список сокращений
БАС – биологически активное соединение; ВКп – высокая концентрация препарата “Неоваскулген”; ДАЦ – диацетат целлюлозы; КМ – костный мозг; ММСК – мультипотентные мезенхимальные стромальные клетки; НВГ – генотерапевтический препарат “Неоваскулген”; НКп – низкая концентрация препарата “Неоваскулген”; ПАВ – поверхностно активное вещество; ПДЛГА– поли(D,L-лактид-со-гликолид); ПКЛ – поли- ε-капролактон; ТИК – тканеинженерная конструкция; PLCL – поли(L-лактид-со-ε- капролактон); PLLGA – поли(L-лактид-со-гликолид); ЭКЖП – эпителиальные клетки желчного протока; EGF – эпидермальный фактор роста; GFP – зеленый флуоресцентный белок; PBS – фосфатно-солевой буфер; VEGF – фактор роста эндотелия сосудов.