Разработка биологических методов утилизации токсичных фосфонатов и других фосфорорганических соединений, отходов их производства и продуктов разложения рассматривается российскими и зарубежными специалистами в качестве основной альтернативы их сжиганию [8, с. 4067].
В этом плане актуальными являются исследования по созданию биологических консорциумов на основе разных штаммов-биодеструкторов, разработке новых биотехнологических подходов комплексного использования их для уничтожения фосфонатов в природных и искусственных средах [2, с. 2]. Практический интерес представляет использование почвенных псевдомонад, способных разлагать ксенобиотики и одновременно осуществлять биосинтез биологически активных и полезных для растений веществ [7, с. 12].
Сотрудниками биологического факультета ВятГУ был проведен анализ групповой принадлежности и выделение почвенных микроорганизмов в местах регулярного применения N-фосфонометилглицина (глифосата).
Для тестирования чувствительности псевдомонад к глифосату использовали препарат Раундап («Монсанто», США), содержащий 36 % глифосата.
Для выделения бактерий рода Pseudomonas использовали накопительную среду состава, (г·дм-3): MgSO4·7Н2О — 0,2; К2НРО4 — 1,0; FeSO4·7Н2О — 0,05; CaCl2 — 0,02; MnCl2·4H2O — 0,002; Na2MoO4·2H2O —0,001; C2Н5ОН — 4,0; NH4Cl — 1,0, вода дистиллированная — до 1 дм3.
В качестве минимальной среды для бактерий использовали синтетическую среду следующего состава, (г,мл×дм-3): К2НРО4 — 8,71; 5 М NH4C1 — 1,0; 0,1 М Na2S04 — 1,0; 62 мМ MgCl2 — 1,0; 1 мМ СаС12 — 1,0; 0,005 мМ (NH4)6Mo7O24·4H2O — 1,0, микроэлементы — 1,0. Раствор микроэлементов в 10%-ной НС1 содержал, г/л: ZnO — 0,41; FeCl2·6H2O — 5,4; МnС12·4Н2О — 2,0; CuCl2·2H2O — 0,17; Co Cl2·6H2O — 0,48, Н3ВО3 — 0,06; рН 7,0.
Для выращивания микробных культур использовали агаризованную (2,0 %) среду Лурия-Бертани и жидкую среду Лурия, содержащие, г/дм3: бактотриптон — 10,0; дрожжевой экстракт 5,0:NaCl — 10,0 (все Difco, США).
Анализ групповой принадлежности почвенных микроорганизмов, получение накопительных и чистых микробных культур проводили общепринятыми методами [1, с. 152; 3, с. 56; 6, с. 421]. Родовую и видовую принадлежность выделяемых получаемых микробных культур проводили с использованием идентификационных тест-систем (наборов) МИКРО-ЛА-ТЕСТ, производства PLIVA — Lachema (Чехия) и прилагаемых к ним Codebook. Количественный анализ содержания глифосата проводили хроматографическим методом [4, с. 243].
Микробную обсемененность исследовали в пробах почвы, отобранных на участках сельхозугодий в Оричевском и Нововятском районах Кировской области, которые многократно подвергались воздействию N-фосфонометилглицина. В качестве контрольных одновременно отбирались пробы в районе тех же участков, не в тех же районах. При каждой обработке методом распыления расход на 100 м2 поля, предназначенного под посев овощных культур и картофеля, в среднем составлял 5 литров воды, содержащей 65—70 мл 36 %N-фосфонометилглицина. В июле 2011 г было отобрано четыре группы по 7 проб в каждой: 1 группа — пробы почвы, не обрабатываемой ранее гербицидами (контроль почвы перед обработкой N-фосфонометилглицином); 2 группа — пробы почвы обработанной 5—8 раз в предшествующие три года (2008—2010 гг.) в весенне-летний период, при этом с последней обработки прошел год; 3 группа — пробы почвы обработанной однократно в конце мая — начале июня 2011 гг., с обработки до взятия пробы прошло три недели; 4 группа — пробы почвы обработанной 5—8 раз в предшествующие три года (2008—2010 гг.) в весенне-летний период и дополнительно — однократно в течение мая — июня 2011 гг., с последней обработки до взятия проб прошло три недели. Результаты анализов свидетельствовали, что численный состав и соотношение популяций микроорганизмов менялись в зависимости от количества обработок гербицидом.
В 1 группе (контрольной) проб средняя концентрация микроорганизмов составляла 8×107 КОЕ/г, в 2—4 группах, 2×107; 7×104; 4×106 соответственно. Полученные результаты свидетельствуют, что обработка гербицидом почвы приводит к резкому снижению концентрации микроорганизмов в ней, через три недели после однократной обработки N-фосфонометилглицином количество микроорганизмов снижалось до 7×104 или более чем в 103 раз меньше, чем в контроле. Через год после обработки гербицидом концентрация микроорганизмов в почве в значительной степени восстановилась, но была ниже, чем в контроле в 4 раза. Результаты анализа четвертой группы проб свидетельствовали, что микрофлора почвы, регулярно подвергавшейся обработке глифосатом, стала устойчива к повторным воздействиям гербицида и быстрее восстанавливалась: через три недели после обработки содержание микроорганизмов в пробах группы 4 было в 57 раз выше, чем в пробах группы 3.
Исследование изменений содержания микроорганизмов разных групп (в процентах от общего их количества в пробах) в зависимости от кратности и сроков обработки глифосатомпоказало, что в результате многократной обработки гербицидом количество протеобактерий снижается (по отношению к контролю) с 57 % до 16 %, микромицетов повышается с 11 % до 41 %, содержание грамположительных бактерий, актиномицетов и цианобактерий в пробах колеблется соответственно на уровне 21—29 %; 2—7 % и 6—12 % соответственно.
В ходе исследований в пробах почвы были выделены и идентифицированы 20 изолятов бактерий рода Pseudomonas, относящихся к родам aeruginosa,fluorescens, mendocina, pseudoalcaligenes, putida, stutzeri, которые обладали более выраженной устойчивостью к токсическому действию глифосата в сравнении с контрольными лабораторными штаммами не контактировавшими с глифосатом.
При этом три изолята (два — P. fluorescens и один — P. putida), составляющие 15 % от всех выделенных культур, были способны к росту в жидкой среде, содержащей 0,4 мкг/см3N-фосфонометилглицина, 13 изолятов (65 %) и 4 изолята (20 %) псевдомонад были способны к росту в жидкой среде, содержащей соответственно 0,1 и 0,025 мкг/см3N-фосфонометилглицина.
Проведенные исследования позволили сделать выводы:
1.Многократное применение глифосата в качестве гербицида приводит к изменению структуры микробного сообщества почвы за счёт снижения относительных концентраций протеобактерий с 57 % до 16 %, актиномицетов — с 7 % до 2 %, и возрастания содержания микромицетов с 11 % до 41 %, грамположительных бактерий с 21 % до 29 %, цианобактерий — с 6 % до 12 %.
Нужна помощь в написании статьи?
Мы - биржа профессиональных авторов (преподавателей и доцентов вузов). Пишем статьи РИНЦ, ВАК, Scopus. Помогаем в публикации. Правки вносим бесплатно.
2.Устойчивость отдельных изолятов P. fluorescens и P. putidaболее чем в 6 раз превосходила устойчивость лабораторных штаммов этих же родов, которые не были в контакте с N-фосфонометилглицином.
Список литературы:
Виноградский С.Н. Микробиология почвы. Изд-во АН СССР, 1952. — 370 с.
Жариков М.Г. Эколого-токсикологическая оценка воздействия глифосата при многолетнем применении на элементы агроценоза и биоремедиация загрязненных территорий: автореф. дис. на соиск. уч. степ.канд. биол. наук. М.: 2010, МСХА им. К.А. Тимирязева. — С. 1—20.
Звягинцев Д.Г., Бабьева И.П., Зенова Г.М. Биология почв. М.: Изд-во МГУ, 2005. — 445 с.
Клисенко М.А., Калинина А.А., Холькова Г.А. Методы определения микроколичеств пестицидов в продуктах питания, кормах и внешней среде: справочник в 2 т. М.: Колос, 1992. Т 1. — 567 с.
Кононова С.В., Несмеянова М.А. Фосфонаты и их деградация микроорганизмами // Биохимия. — 2002, Т. 67, Вып. 2, № 6. — С. 220—233.
Нетрусов А.И., Егорова М.А., Захарчук Л.М. и др. Практикум по микробиологии. М.: Академия, 2005. — 608 с.
Смирнов В.В., Киприанова Е.А. Бактерии рода Pseudomonas. Киев: Наук. дум., 1990. — 264 с.
Moneke A.N., Okpala G.N., Anyanwu C.U. Biodegradation of glyphosate herbicide in vitro using bacterial isolates from four rice fields African // Journal of Biotechnology. — 2010. — Vol. 9 (26). — P. 4067—4074.