В судебной и клинической токсикологии для рутинного скрининга (нецелевого поиска) наркотических и лекарственных веществ в биологических жидкостях широко используют метод газовой хроматографии с масс-селективным детектором. Но количественное определение баклофена методом газовой хроматографии затруднено, так как при использовании стандартных методик определения после дериватизации с уксусным ангидридом баклофен ацетилируется не полностью и на хроматограмме наблюдается два пика [3].
Баклофен может быть определен методом высокоэффективной жидкостной хроматографии, но существующие методики предусматривают использование дорогостоящих и труднодоступных реагентов и детекторов и сложны для использования при рутинном анализе [6, 7].
Целью данной работы являлась разработка методики количественного определения баклофена в крови методом высокоэффективной жидкостной хроматографии.
Экспериментальная часть
В качестве объектов исследования были выбраны таблетки баклофена «POLPHARMASA» (10 мг), а так же образцы крови, предварительно проверенные на отсутствие лекарственных веществ, предоставленные КГБУЗ «Красноярское краевое бюро судебно-медицинской экспертизы».
В работе использовали высокоэффективный жидкостной хроматограф Agilent Technologies 1200 с многоволновым диодно-матричным детектором. Колонка PhenomenexLuna5uC18(2) 100 A, 250×4,6 мм; предколонка EclipseXDB-C18 4-Pack4,6×12,5 мм, 5 мкм. Температура термостата колонки 30 0С.
Пробоподготовку образцов крови проводили следующим образом: к 1 мл крови добавляли раствор баклофена в спирте с концентрацией 1 мг/мл, перемешивали, добавляли 1 мл дистиллированной воды и 2 мл ацетонитрила, выдерживали на ультразвуковой бане 10 мин, центрифугировали 5 мин при 3000 об/мин. Верхний слой отбирали пипеткой и упаривали до объема 1 мл.
Результаты и обсуждения
Было исследовано влияние подвижных фаз различного состава на чувствительность определения. Выбор состава подвижных фаз был основан на кислотно-основных свойствах баклофена. Баклофен является амфолитом, так как содержит в молекуле одновременно кислотный и основный центр. Для получения оптимальных параметров удерживания необходимо создание такого значения рН подвижной фазы, при котором молекулы данного вещества будут находиться преимущественно в одной ионной форме, чтобы увеличить хроматографический отклик и предотвратить размывание хроматографической зоны. Определение проводили в диапазоне рН 1,8 — 9,5, соответствующем рабочему диапазону большинства неполярных колонок для обращено-фазового варианта жидкостной хроматографии.
В качестве модификатора подвижной фазы для создания кислых значений рН была выбрана о-фосфорная кислота, т. к. ее растворы имеют минимальное поглощение в диапазоне длин волн 190—400 нм. Для создания щелочной среды элюента использовали сильное органическое основание – триэтиламин (рКа 10,87).
Для стабилизации значения рН водного компонента подвижной фазы использовали:
раствор о-фосфорной кислоты, рН от 1,8 до 5,5;
раствор гидрофосфата калия с о-фосфорной кислотой, рН от 1,8 до 5,5;
фосфатный буферный раствор, рН 8,0;
раствор триэтиламина, рН 7,5 и 9,5.
Количественное определение проводили при длине волны 220 нм, которая соответствует максимуму поглощения баклофена [5].
Установлено, что при использовании подвижных фаз с рН 1,8 — 5,5 время удерживания баклофена и величина аналитического сигнала практически не изменяются в зависимости от состава подвижной фазы и величины рН.
Нужна помощь в написании статьи?
Мы - биржа профессиональных авторов (преподавателей и доцентов вузов). Пишем статьи РИНЦ, ВАК, Scopus. Помогаем в публикации. Правки вносим бесплатно.
При использовании в качестве модификатора водного компонента подвижной фазы раствора триэтиламина с рН 9,5 наблюдается увеличение аналитического сигнала примерно в 2 раза по сравнению с величиной аналитического сигнала для подвижных фаз с рН<7.
Сравнение зависимости площади пика от концентрации для различных значений рН представлены на рисунке 1.
Рисунок 1 – Зависимость площади пика от концентрации при различных значениях рН: 1 – 9,5; 2 – 8,0; 3 – 3,5; 4 – 2,5
Соблюдается линейная зависимость между величиной площади пика и концентрацией баклофена в диапазоне от 0,5 до 100 мкг/мл.
На основании сравнения зависимости площади пика от концентрации и метрологических характеристик методик сделан вывод о том, что самая высокая чувствительность наблюдается при использовании в качестве модификатора подвижной фазы раствора триэтиламина.
Для оценки правильности методики определения баклофена с триэтиламином была проведена статистическая обработка результатов анализа. Для всего диапазона определяемых концентраций относительное стандартное отклонение не превышает 4 %.
Данная методика была опробована на образцах крови, в которые было добавлено известное количество баклофена. Хроматограмма экстракта крови с содержанием баклофена 50 мкг/мл приведена на рисунке 2.
(С=50 мкг/мл, λ=220 нм)
Рисунок 2 – Хроматограмма экстракта крови, содержащей баклофен
В выбранных условиях пробоподготовки степень извлечения составила 70 %, а относительное стандартное отклонение не превышает 3 %.
Заключение
Исследовано влияние состава подвижной фазы на хроматографические характеристики определения баклофена методом высокоэффективной жидкостной хроматографии. Показано, что наибольшая величина аналитического сигнала наблюдается при использовании в качестве модификатора водного компонента подвижной фазы раствора триэтиламина. Минимальная концентрация баклофена, определяемого по данной методике, составляет 0,5 мкг/мл.
Таким образом, метод высокоэффективной жидкостной хроматографии может быть использован для количественного определения баклофена в судебно-химической экспертизе.
Список литературы:
Киреева, А. В. Химико-токсикологическое исследование доксиламина / А. В. Киреева, А. Б. Вожева, С. М. Бахтина, С. В. Волченко, В. Н. Куклин // Судебно-медицинская экспертиза. – 2007. – Т. 50, № 3. – С. 22 — 23.
Киреева, А. В. Химико-токсикологическое исследование буторфанола / А. В. Киреева, А. Б. Зеленцова, Н. В. Сайгушкин, А. А. Ваталев, С. В. Волченко, В. Н. Куклин // Судебно-медицинская экспертиза. – 2008. – Т. 51, № 2. – С. 23 — 26.
Мелентьев, А. Б. Влияние рН среды водной фазы на экстракцию веществ с различными кислотно-основными свойствами / А. Б. Мелентьев // Журнал судебно-медицинской экспертизы. – 2003. – № 2 – С. 40—43.
Мюллер, Р. К. Токсикологический анализ / Р.К.Мюллер. – M.: Наука, 1995. – 562 с.
European Pharmacopoeia 6th Edition, Supplement 6.1. – Strasbourg: European Directorate for the Quality of Medicines, 2007, 310 p.
Millerioux, L. High-performance liquid chromatographic determination of baclofen in human plasma / L. Millerioux, M. Brault, V. Gualano // Journal of chromatography A. – 1996. – Vol. 729, № 4 – P. 309—314.
Vaccher, C. Preparative resolution of sacloven and hydroxysaclofen wit analytical-scale high-performance liquid chromatography / C. Vaccher, P. Berthelot, N. Flouquet, M. Vaccher, M. Debaert // Journal of chromatography A. – 1996. – Vol. 732, № 11. – P. 239—243.