ABSTRACT
Peculiarities of osalmide and paracetamol antioxidant effect in the process of initiated by free radicals and catalytic oxydation of lipid substrates have been studied. It has been found that compounds in oxidation process act by two mechanisms: react with peroxy radicals with constant rate of reaction k7=6, 86´104 (М×с)-1 (osalmide) and k7=4, 00´104 (М×с)-1 (paracetamol), and also beat hydroperoxides (70—75 %) with molecular species formation. High antioxidant activity of paracetamol in anhydrous induced medium and low antioxidant activity in water-lipid catalyzed medium have been established.
Ключевые слова: антиоксиданты; a-токоферол; дибунол; осалмид; парацетамол; пероксидное окисление; антиоксидантная активность.
Keywords: antioxidants; a-tocopherol; dibunol; osalmide; paracetamol; peroxide oxydation; antioxidant activity.
Настоящая работа является продолжением наших исследований [5, 6, 8—12], посвященных тестированию антиоксидантных свойств органических соединений различной структуры (фенолов, аминов, серосодержащих соединений) кинетическими методами.
В последние годы в связи с универсальным механизмом регулирования проницаемости биомембран используют антиоксидантотерапию при лечении и профилактике различных патологий [3, 4, 13], при этом подбор антиоксидантов ведется, как правило, на основе данных об антиоксидантной активности соединений в безводном инициируемом свободными радикалами субстрате. Известно, что процессы окисления протекают в живой клетке в липидном бислое в водно-ионном окружении. Очевидно, что эффективность ингибиторов в биомембранах может существенно отличатся от данных в химическом эксперименте. Прогресс в области антиоксидантотерапии возможен только на основе предварительного отбора антиоксидантов (АО) с помощью моделей, приближенных к условиям биологической среды. Разработке такой кинетической модели были посвящены наши предыдущие работы [6, 12]. В результате были подобраны оптимальные условия тестирования АО в каталитическом окислении эфиров высших ненасыщенных жирных кислот в водно-липидной среде. Установлено, что каталитическое окисление липидов в мицеллах протекает в 1000 раз быстрее, чем при инициированном окислении в безводной среде. Показано, что зависимости антиоксидантных свойств органических соединений от структуры, установленные в условиях инициированного окисления углеводородов, существенно меняются в условиях каталитического окисления липидных субстратов.
Цель настоящей работы — тестирование антиоксидантной активности осалмида и парацетамола в процессе инициированного и каталитического окисления липидных субстратов в сравнении со стандартными антиоксидантами дибунолом и a-токоферолом.
МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ
Антирадикальную активность (АРА) соединений тестировали в системе инициированного окисления этилбензола хемилюминесцентным методом (ХЛ) [14]. Окисление инициировалось азо-бис-изо-бутиронитрилом (АИБН) при t=(60±0,2)0С. Скорость зарождения свободных радикалов определялась экспериментально с помощь реперного ингибитора – хромана С и составила 2,3´10-8 М´с-1. Для усиления свечения использовался люминофор 9,10- дибромантрацен в концентрации 5´10-4 М, не оказывающий влияния на кинетику окисления. Концентрация ингибитора составляла (1-5)´10-4 М. Стехиометрический коэффициент ингибирования f, показывающий число радикалов, гибнущих на одной молекуле антиоксиданта, оценивали по значению тангенса угла наклона зависимости периодов индукции от концентрации введенного ингибитора, либо по формуле:
.
Антиоксидантную активность (АОА) изучали волюмометрическим методом в присутствии инертного растворителя хлорбензола в манометрических установках типа Варбурга при окислении модельного субстрата — метилолеата (МО) [7]. Процесс инициировали за счет термического разложения при t=(60±0,2)0С АИБН в концентрации 3×10-3 М, скорость инициирования в условиях эксперимента составляла 4,2×10-8 М×с-1. Кинетику каталитического окисление изучали волюмометрическим методом в модифицированной установке типа Варбурга при окислении этилолеата (ЭО), в присутствии триметилцетиламмоний бромида (ЦТМАБ) в качестве поверхностно-активного вещества (ПАВ) при концентрации 1 × 10-3 М в пробе, с добавками растворов хлорида меди (II) в конечной концентрации 2×10-3 М при t=(60±0,2)0С [12]. Соотношение липидов и воды составляло 1: 3, а общий объем пробы 4 мл. Графическим методом определяли величину периода индукции (ti), представляющей собой отрезок оси абсцисс, отсекаемый перпендикуляром, опущенным из точки пересечения касательных, проведенных к кинетической кривой. Эффективность торможения процесса окисления липидного субстрата определяли совокупностью реакций ингибитора и обозначали как антиоксидантную активность, количественно рассчитанную по формуле АОА= ti-tS /tS, где tS и ti — периоды индукции окисления субстрата в отсутствие и в присутствии исследуемого АО соответственно, сравнивали с действием ингибитора, принятого за стандарт, используя отношение ti / tреп, где tреп. — период индукции реперного (стандартного) ингибитора. Из наклона кинетических кривых (КК) определяли начальную (Wнач.) и максимальную (Wмах.) скорости окисления липидного субстрата с добавками АО. Скорость инициирования определяли уравнением Wi = f [InH] / ti, где f — стехиометрический коэффициент ингибирования, [InH] — концентрация ингибитора, ti — период индукции. В качестве стандартных ингибиторов использовали a-токоферол и дибунол, при этом концентрации АО были сравнимыми. Кинетику накопления гидропероксидов изучали методом обратной йодометрии при аутоокислении линолевой кислоты (ЛК) при t=(60±0,2)0С в среде хлорбензола.
РЕЗУЛЬТАТЫ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ
В медицине парацетамол используется как противовоспалительное, жаропонижающее и обезболивающее средство. Известно, что парацетамол ингибирует фермент циклооксигеназу и тормозит образование простагландинов, участвующих в механизме возникновения гиперальгезии и повышенной температуры. Салициловую кислоту используют как антисептическое средство. Осалмид, производный салициловой кислоты и пара-аминофенола, применяется как желчегонное средство. Формулы изучаемых соединений представлены в таблице 1.
Таблица 1.
Химические формулы изучаемых антиоксидантов
Методом хемилюминесценции в группе исследуемых соединений была оценена величина константы скорости реакции k7 фенолов с пероксильными радикалами [7]: RO2·+InH 
ROOH + In·, где InH — ингибитор окисления, In• — радикал ингибитора, RO2• — пероксильный радикал. Стехиометрический фактор ингибирования f, показывающий количество свободных радикалов, реагирующих с молекулой ингибитора, для большинства изучаемых соединений был близок 2—2,5 (табл. 2). При исследовании кинетики изменения интенсивности ХЛ в присутствии исследуемых соединений было установлено, что все АО оказывают ингибирующее действие на процесс окисления модельного субстрата. Показано, что наибольшую активность в реакции с пероксильными радикалами проявлял осалмид, константа скорости реакции k7 которого обусловлена акцепторным характером заместителя в пара-положении, наличием p-р-сопряжения между амино-группой и фенолом. АРА осалмида складывается из активности двух гидроксильных групп, в парацетамоле донорный заместитель содержится в пара-положении. Фенол и салициловая кислота в реакции с пероксильными радикалами проявляли низкую активность, значения k7 для указанных соединений были сопоставимы между собой (табл. 2). Сравнение констант скорости реакции k7 исследуемых соединений и a-токоферола показывает, что основной природный АО более активен в реакции с пероксильными радикалами в 360 раз.
Таблица 2.
Значения константы скорости реакции АО с пероксильными радикалами RO2● ; Wi=2,3×10—8 М×с-1; САО= 1´10-3 М; t=600
Нужна помощь в написании статьи?
Мы - биржа профессиональных авторов (преподавателей и доцентов вузов). Пишем статьи РИНЦ, ВАК, Scopus. Помогаем в публикации. Правки вносим бесплатно.
Для сравнительного анализа антиоксидантного действия исследуемых и реперных ингибиторов были определены периоды индукции, начальные и максимальные скорости окисления. Процесс инициировали посредством термического радикального распада АИБН по реакции:
Радикал инициатора (Ri·) конкурентно взаимодействовал с липидным субстратом по реакции:
Ri· + RH ®RiH + R·
Далее радикалы липидного субстрата (R·) взаимодействовали с кислородом по реакциям:
R· + O2 ® RO2·
RO2· + RH ® ROOH + R·
ROOH ® RO· + OH·
В присутствии ингибиторов возможны следующие реакции:
RO2· + InH ROOH + In·
In· + RH 
R· + InH
RO2· + In·
молекулярные продукты
ROOH + InH молекулярные продукты
Ингибирующее действие указанных соединений тестировали в широком диапазоне концентраций (5,0´10-5 —2´10-3 М) в условиях инициированного окисления в среде хлорбензола. На рис. 1 приведены кинетические кривые окисления МО в присутствии равных концентраций различных АО. Показано, что исследуемые АО увеличивали периоды индукции окисления модельного субстрата МО. Видно, что наклон кинетических кривых по сравнению с контролем практически не изменялся для одних АО (фенол, салициловая кислота, дибунол, a-токоферол) и существенно снижался для осалмида и парацетамола. Для осалмида, парацетамола и дибунола наблюдалась линейная зависимость между периодом индукции и концентрацией. Для фенола и салициловой кислоты концентрационные зависимости имели экстремальный характер. С увеличением их количества эффективность АО постепенно снижалась. Из рис. 2 можно видеть, что при концентрациях свыше 1´10-3 М
Рисунок 1. Кинетические кривые поглощения метилолеата в среде хлорбензола в присутствии АО: 1 — контроль, 2 — фенол, 3 — салициловая кислота, 4 — a-токоферол, 5 — дибунол, 6 — осалмид, 7 — парацетамол. С АО = const = 2´10-4 М, Wi= 4,2´10-8 М-1´c-1, t = 600С.
Рисунок 2. Зависимость периодов индукции от концентрации АО: 1 — парацетамол, 2 — дибунол, 3 — a-токоферол, 4 — осалмид, 5 — фенол, 6 — салициловая кислота. Wi= 4,2´10-8 М-1´c-1, субстрат окисления – метилолеат, среда — хлорбензол, t=60 0С
фенол и салициловая кислота как ингибиторы окисления малоэффективны. Следует отметить, что низкая ингибирующая активность салициловой кислоты связана также со слабыми взаимодействиями (внутримолекулярной водородной связью) между ОН-группой фенола и карбонилом –С=О кислоты, что мешает ОН-группе участвовать в реакции с пероксильными радикалами. Действие a-токоферола в изучаемом диапазоне концентраций описывалась линейной зависимостью (рис. 2).
Таблица 3.
Кинетические параметры инициированного окисления метилолеата в присутствии различных концентраций исследуемых антиоксидантов Wi= 4,2´10-8 М-1´c-1, t=60 0С
Нужна помощь в написании статьи?
Мы - биржа профессиональных авторов (преподавателей и доцентов вузов). Пишем статьи РИНЦ, ВАК, Scopus. Помогаем в публикации. Правки вносим бесплатно.